循环肿瘤细胞上皮间质转化的研究进展

2021-03-26李奇栋许庆文孙利君广东医科大学附属医院胃肠外科广东湛江524000

广东医科大学学报 2021年1期

李奇栋，许庆文，孙利君（广东医科大学附属医院胃肠外科，广东湛江 524000）

由于人口老龄化和工业化的进展，生活方式的改变等原因，恶性肿瘤已成为严重威胁全世界人群健康的主要公共卫生问题之一。根据GLOBOCAN 2018显示，全球恶性肿瘤新发病例约1808万例，死亡病例约956万例[1]，中国新发与死亡病例分别约占23.7%和30.0%，发病率均高于世界平均水平。面对这一严重问题，肿瘤的早期诊断与及时治疗成为了关键。近些年来，生物技术获得巨大进展，随着精准医疗的大力推进，肿瘤的“液体活检”被提出并且备受关注，其中循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)作为“液体活检”的一种，CTCs只需抽取患者少许静脉血作为标本即可，且具有特异性强的特点。随着近些年来，关键技术问题的解决，CTCs在临床的应用逐渐兴起。

1 CTCs

1869年，澳大利亚病理学家 Thomas Ashworth首次提出了循环肿瘤细胞，是指由实体肿瘤细胞受到细胞内外多种细胞因子的作用和调控下从肿瘤组织脱落或进入血液循环，而这其中绝大多数的肿瘤细胞在免疫系统的识别杀伤及自身凋亡的作用下死亡，只有极为少数的肿瘤细胞存活下来，这些细胞具有极高的侵袭作用和转移倾向，它们发生黏附、聚集并在特定的条件下形成肿瘤微栓，继而实现了肿瘤的侵袭转移[2]。相比传统的辅助检测外周血中的CTCs快捷无创，对于早期发现肿瘤、动态检测疗效和评估预后等都具有极高的临床应用价值。

2 上皮间质转化(EMT)

细胞通过下调上皮特性并获得间质特性的想法是在 20世纪 80年代初由 Elizabeth Hay提出的，她描述了鸡胚胎原始发育中上皮到间质的表型变化，从而提出 EMT[3]。EMT是指上皮表型细胞在一定条件的下出现上皮表型的特征蛋白表达下调而间质表型细胞的特征蛋白表达上调即细胞发生细胞极性丢失，使得运动能力增强的过程[4]。在这过程中，细胞不仅下调上皮表型蛋白的表达，同时改变其基因的表达程序，使得细胞骨架结构及形态学发生转变，并改变细胞与细胞外基质的相互作用，从而促进细胞的迁移。EMT是胚胎发育(Ⅰ型)和伤口愈合(Ⅱ型)中不可或缺的一部分，并在病理上促进肿瘤的发生发展(Ⅲ型)。EMT的过程中复杂的细胞表型和分子标志物的变化是由多个转录因子调控的信号通路参与并调节其发生与变化。

2.1 EMT的效应蛋白

许多著名的 EMT效应蛋白都是亚细胞结构蛋白，这些蛋白可以区分细胞的上皮或间质表型。在EMT过程中，上皮表型的特征性蛋白的关键分子成分受到不同程度的调控。例如，E-钙黏素(Ecadherin)、细胞角蛋白(Cytokeratin)、桥粒蛋白(Desmoplakin)和紧密连接蛋白(Occludin)等，都有不同程度的下调，其中 E-钙黏素被认为是上皮细胞表型的关键，它维持着上皮细胞之间的稳定性和细胞极性[5]。当上皮来源的肿瘤细胞发生 EMT时，E-钙黏素的基因转录受到抑制[6]，启动子甲基化以及蛋白质磷酸化和降解都使其表达下调[7-8]，导致细胞的黏附连接的分解，编码紧密连接蛋白和桥粒蛋白的基因亦受到抑制，这促进了紧密连接和桥粒连接的溶解。此外，E-钙黏素的下调，证实可以让从原位脱落的肿瘤细胞避免失巢凋亡的影响[9]。这些基因表达的变化抑制了上皮细胞的连接，并使其失去游离面-基底面极性[10]。

而一些非上皮性钙黏素，如 N-钙黏素(Ncadherin)，整合素β6(Integrin β6)在 EMT发生后表达增加[11]。具体来说，E-钙黏素的下调被 N-钙黏素的表达增加平衡[12]，经过这种平衡，细胞失去了与上皮细胞的联系，获得了对间质细胞的亲和力[13]。与E-钙黏素的作用相反，N-钙黏素通过α-catenin和βcatenin与细胞骨架连接，N-钙黏素还激活 Rho家族GTPase信号通路，增强成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路，并调节 Wnt信号通路。纤维连接蛋白(Fibronectin)是间质表型细胞迁移所需的一种细胞外蛋白，经常在 EMT激活时被诱导。此外，在 EMT的过程中的中间丝组成随着细胞角蛋白的抑制和波形蛋白(Vimentin)表达的激活而改变。

综上所述，EMT效应分子的切换不仅有助于肿瘤细胞的运动，而且在某种程度上还促进它们在血流中的增殖和生存能力，从而增加了远处转移形成的可能性。

2.2 调控EMT的转录因子

EMT程序的执行使得细胞发生骨架的改变及形态学的转变，而调控 EMT的转录因子逐渐被发现。总体来说，下面三类转录因子被证明是在 EMT过程中的关键，因此被认为是EMT的核心转录因子。

第一类是含有锌指结构的 DNA结合蛋白 Snail，包括 Snail1和Snail2，它们在胚胎发育、伤口愈合、肿瘤发生发展期间激活 EMT。Snail通过羧基末端的锌指结构域与E-钙黏素基因启动子区的E-box区域结合来抑制上皮表型基因，使 E-钙黏素表达下降，除了抑制上皮表型基因外，Snail还激活了促进间质表型的基因，使得 N-钙黏素表达上调[14-15]。多项研究表明，Snail的异常表达与乳腺癌[16]、肺癌[17]、结直肠癌[18]等多种肿瘤的 EMT、侵袭、转移都密切相关。

第二类是碱性螺旋-环-螺旋转录因子 Twist，包括 Twist1和Twist2，过往研究显示，Twist的作用于Snail相似，Twist表达下调上皮表型基因，激活间质基因表达，在癌细胞中，Twist抑制 E-钙黏素并 N-钙黏素的表达，并不依赖 Snail[19]。最近，有研究证明Twist可上调波形蛋白的表达，促使结直肠癌HCT116细胞及 SW480细胞形态学上转变为代表间质表型的梭形，上调其侵袭能力[20]。该研究表明，Twist调控结直肠癌细胞的 EMT程序，促使其侵袭及转移[21]。另有研究证明，缺氧诱导因子1α(hypoxia indu-cible factors1α，HIF1α)在缺氧条件下可诱导Twist表达[22]，从而促进 EMT。此外机械应激诱导果蝇黑腹上皮细胞中Twist表达，该方式依赖于β-catenin[23]。

第三类是 ZEB家族的ZEB1，属于锌指蛋白类的转录因子。ZEB1作为EMT的转录因子，其最显著的作用是直接抑制 E-钙黏素的表达，也有报道称，ZEB1可以控制涉及EMT其他方面的基因表达，例如可直接激活波形蛋白、抑制极性蛋白1(protein associated with Lin seven 1，PALS1)及激活基质金属蛋白酶如膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type-1 matrix metalloprpteinase，MT1-MMP)[24]，从而促进肿瘤转移。

除了上述核心转录因子，还发现其他转录因子可以诱导或调节 EMT程序，其中有一部分属于GATA家族，其特征是具有与DNA结合的双锌指结构域，控制着不同细胞的分化，它们通过调节上皮细胞之间的连接所需基因的表达来促进 EMT，还有一些是属于 SOX家族，它们与Snail1和Snail2协同驱动EMT。这些新发现的转录因子对 EMT程序的调控作用，以及与Snail、Twist或 ZEB1的功能关系还没有很好的确定。

总之，在 EMT过程中，不同的转录因子在不同类型的细胞或者组织下，通过不同的信号通路传导有着不同的影响，它们互相调控彼此的表达，对目标基因上进行效应性整合，进而在转录水平上促进EMT过程。

2.3 EMT诱导物

一般认为，肿瘤细胞发生的 EMT是对肿瘤微环境中的细胞外信号作出的反应，这其中是多种信号通道共同合作的结果。转化生长因子 -β(transforming growth factor-β)信号通路在肿瘤的 EMT过程中有着重要作用，通过是否存在 Smad介导的可以将TGF-β信号通路分为：Smad介导的 TGF-β信号通路，即TGF-β与细胞膜上 TGF-β受体Ⅱ结合，被活化的TGF-β受体Ⅱ募集并结合TGF-β受体Ⅰ，形成异源三聚体，使 Smad2/Smad3磷酸化，Smad4参与协助活化的 R-smad向核转移并保持其转录活性，进入细胞核后使 Snail、Twist、ZEB1等转录因子表达增加，从而调控EMT[25]。其中Smad复合物不仅能激活特异性转录因子的表达，而且还能提高转录因子的活性，TGF-β通过 Smad3的转录诱导 Snail1的表达，而Smad3还可以间接诱导 Snail2的表达。Smad3-Smad4协同 Snail1，从而进一步增加 TGF-β的激活对 E-钙黏素和紧密连接蛋白编码蛋白的抑制作用。

非 Smad介导的 TGF-β信号通路，它是通过激活PI3K-AKT-mTOR信号通路进行转录调控[26-27]，进而激活 mTORC1和mTORC2，其中 mTORC1促进细胞发生形态学改变、蛋白质合成、运动性和侵袭性的增加，而 mTORC2是细胞由上皮表型转变为间质表型所必需。另一方面，TGF-β刺激PAR6(维持上皮细胞极性和紧密连接的调节器)在细胞紧密连接处被TGF-β受体 II磷酸化，磷酸化后的 PAR6与其互相作用，导致紧密连接的丧失[28]。TGF-β还可以诱导RhoA的活性[29]，通过激活透明蛋白(DIA1)和Rho相关激酶(ROCK)来促进肌动蛋白重组，磷酸化肌球蛋白轻链(MLC)，激活 LIM激酶(LIMK)，从而抑制丝切蛋白(cofilin)[30]。TGF-β还能通过影响其他诱导 EMT过程的信号通路，如 Notch、Wnt以及整合素信号通路等。除了TGF-β信号通路，Wnt/β-catenin信号通路亦被证明与EMT的诱导有关[31]。在 Wnt/β-catenin信号通路中，Wnt蛋白与特异性受体节结合，触发细胞内的信号传导，抑制GSK-3β(糖原合成酶激酶-3β)的活性，使β-catenin(β-连环蛋白)无法被降解而在胞浆积聚，并移向核内。游离的β-catenin在核内与转录因子 TCF/LEF结合，激活与EMT相关的靶基因，降低 E-钙黏素的表达，参与EMT过程[32]。

通过受体酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)的生长因子也可以诱导 EMT。成纤维细胞生长因子(FGF)诱导膀胱癌细胞的EMT伴随着Snail2的表达、桥粒蛋白的缺失[33]，肝细胞生长因子(HGF)通过 MAPK/ERK信号通路诱导 Snail1和Snail2的表达[34]，胰岛素样生长因子-1(IGF-1)受体激活使乳腺上皮细胞下调 E-钙黏素、同时上调 N-钙黏素、波形蛋白及纤维连接蛋白[35]，表皮生长因子则是通过增加对 E-钙黏素的内噬作用，以及通过Snail1和Twist的表达来下调 E-钙黏素[36]。

肿瘤微环境也参与调节 EMT，肿瘤组织过快的生长导致组织缺氧，在缺氧条件下可通过 HIF1α激活 Twist的表达从而启动 EMT[37]。HIF1α还可通过诱导卵巢癌细胞表达Snail1，致使 E-钙黏素缺失[38]。炎症因子白细胞介素-6(IL-6)可通过 JAK-STAT通路诱导Snail1的表达促进EMT[39]。