外泌体在肿瘤发生、发展及化疗耐药中作用的研究进展

(青岛大学附属医院肿瘤内二科，山东 青岛 260003)

外泌体是一种直径为50～100 nm的膜性小泡[1]，其内部含有多种生物活性分子，例如蛋白质、mRNA、miRNA等[2]。外泌体最初在哺乳动物的成熟红细胞中被发现，由细胞内的多泡体与细胞膜融合后分泌产生[3]。外泌体先是作为细胞废物转运体被人们所认识[4]。随着研究的深入，发现外泌体可以参与细胞-细胞间的信息传递[3]，能通过将携带的遗传信息传递给受体细胞，继而对受体细胞的蛋白表达水平产生影响[5]。近期越来越多的研究表明,外泌体与肿瘤也有着密切的关系[6]。目前肿瘤化疗的整体有效率较低，其中获得性化疗耐药是影响治疗效果的主要障碍[7]，而获得性耐药的主要机制包括：肿瘤细胞膜转运蛋白过表达[8]、细胞解毒蛋白激活[9]、化疗药物活性的改变[10]、DNA修复分子的变化[11]、原癌基因激活以及抑癌基因失活[12]等。近几年来研究发现外泌体能通过多种机制诱导肿瘤细胞对化疗产生耐药，如增加受体细胞耐药相关蛋白的表达、介导药物外排、抑制细胞凋亡等[13-14]。这提示我们可以针对外泌体的形成和释放进行干预，为肿瘤的精准治疗提供新的思路。

1 外泌体的合成、释放与信息传递

人体内大多数细胞可以将双层膜结合的纳米囊泡释放到细胞外。这些膜来源的囊泡(通常称为胞外囊泡)根据其大小可以分为3种，外泌体(20～100 nm)、微泡(100～1 000 nm)和凋亡小体(1～5 μm)[15]。外泌体起源于细胞内的多泡体，多泡体为具有内吞作用的囊泡，与质膜融合后一部分被溶酶体降解，另一部分释放到细胞外，成为外泌体[16]。经检测发现，外泌体中含有多种生物分子，包括蛋白质及核酸等。不同来源的外泌体，其内容物有所不同[17]。到目前为止，已经在外泌体中发现了4 563种蛋白质、194种脂质、1 639种mRNA和764种miRNA[18]。作为细胞间信息传递的主要方式，外泌体与靶细胞间进行信息传递的方式主要包括3种。①外泌体膜蛋白与靶细胞膜蛋白相互作用从而激活细胞内的信号通路。外泌体上的纤连蛋白与骨髓瘤细胞上的硫酸乙酰肝素结合后激活p38和pERK信号通路，导致下游靶基因DKK1和MMP-9(促进骨髓瘤进展的两种分子)的表达[19]。②外泌体可以将自身携带的遗传物质转移到靶细胞，使靶细胞表达相应的蛋白。来自小鼠肥大细胞外泌体的mRNA转移至人肥大细胞后，在受体细胞中可发现新的小鼠蛋白质，表明外泌体转移的mRNA在进入另一细胞后可被翻译并表达[20]。③外泌体膜可以与靶细胞膜直接融合，将外泌体中携带的遗传信息直接转运到受体细胞[21-22]，载有萤光素酶表达基因的外泌体能直接通过质膜融合使靶细胞产生生物发光效应[23]。

2 外泌体与肿瘤的关系

癌细胞比健康细胞释放更多的外泌体，其中主要原因为原癌基因的激活[24-25]，这提示着肿瘤与外泌体之间的潜在关系。外泌体通过与受体细胞对接并传递其所携带的蛋白质、DNA、mRNA和miRNA等内容物来调节肿瘤和宿主细胞的功能，并通过在肿瘤微环境及整个机体的传递来促进肿瘤的进展[25]。来源于肿瘤细胞的外泌体具有转移miRNA和促血管生成的作用[26]。以上机制均表明外泌体有助于促进肿瘤细胞的发生与转移。近来大量研究表明外泌体与肿瘤耐药的发生密切相关，其可以通过传递耐药性miRNA赋予敏感细胞耐药性[27]，也可以通过将化疗药物包装入外泌体而排出到细胞外来保护自身细胞免受化疗药物的细胞毒性作用[28]。

2.1 促进肿瘤的发生

肿瘤细胞来源的外泌体通过转运miRNA以及致癌蛋白参与周围细胞的恶性转化。ELMAGEED等[29]研究证实，前列腺癌细胞分泌的外泌体通过转运Ras转录物(H-ras和K-ras)、Rab蛋白(Rab1a、Rab1b、Rab11a)以及致癌miRNA(miR-125b、miR-130b和miR-155)等物质，使肿瘤抑制剂Lats2和PDCD4下调，从而诱导细胞发生间充质-上皮转化，最终发展为前列腺癌细胞。缺氧及乙酰肝素酶刺激外泌体的分泌与乳腺癌的血管生成相关，并且是乳腺癌发生的主要原因之一[30-31]。肿瘤细胞的外泌体中含有pre-miRNA、Dicer、AGO2以及TRBP等物质，而CD43能特异性介导Dicer的累积。据报道，来自乳腺癌病人细胞的外泌体能以Dicer依赖的方式促进非致瘤性上皮细胞转化为肿瘤细胞[6]。同时MELO等[6]证明，抑制肿瘤外泌体中Dicer的作用能明显抑制受体细胞中的肿瘤生长，表明外泌体中的miRNA能促进肿瘤的形成与发展。另外，外泌体还能够通过水平基因转移，将致癌基因转移到靶细胞而促进肿瘤的发生[32]。AL-NEDAWI等[33]的研究发现，含有EGFRvⅢ蛋白的外泌体能够与缺乏EGFRvⅢ蛋白的癌细胞发生质膜融合，导致致癌活性改变，如转化信号传导途径(MAPK和Akt)的激活，EGFRvⅢ蛋白调节基因(VEGF、Bcl-x(L)、p27)的表达改变。例如含有突变KRAS等位基因的结肠癌细胞能够通过分泌外泌体将KRAS突变蛋白转移到KRAS野生型的结肠癌细胞中，从而促进细胞的增殖[34]。以上结果表明，肿瘤细胞衍生的外泌体能在肿瘤发生期间进行细胞间的信息传递。

2.2 促进肿瘤侵袭和转移

MET蛋白是促进肿瘤细胞增殖、运动和迁移的致癌性受体酪氨酸激酶，常在肿瘤细胞中被异常激活[35]。最新研究证实，黑色素瘤来源的外泌体能够在肿瘤转移中发挥作用。晚期黑色素瘤病人外泌体中的MET蛋白增加，并证明黑色素瘤来源的外泌体通过形成转移前微环境及血管生成的增加促进骨髓来源细胞发生转移[36]。据报道，来自成纤维细胞的外泌体在乳腺癌细胞的迁移中起重要作用，成纤维细胞来源的外泌体通过激活Wnt-PCP信号途径促进乳腺癌细胞的侵袭行为[37]。另外，外泌体可以通过血液循环进行全身性传播，并且可以对转运的RNA起保护作用，使其能够作用到远端靶细胞。高度转移的癌细胞能够通过分泌外泌体使受体细胞形成转移前微环境，进而增加肿瘤的转移能力。在癌症研究中发现，随着肿瘤向更具有侵袭性的表型转化，外泌体的分泌常常增加。DEMORY等[34]研究显示，乙酰肝素酶能通过改变外泌体携带的蛋白组合物，如增加syndecan-1、VEGF和HGF(3种与侵袭性肿瘤表型相关的蛋白)的表达，而增加肿瘤的侵袭性。乙酰肝素酶能通过上调MMP9表达水平以及降解多配体聚糖-1中硫酸乙酰肝素链的长度促使多配体聚糖-1从肿瘤细胞表面上脱落，暴露出VLA-4和VEGFR2的结合位点，激活VEGFR2信号传导通路，从而促进血管生成和肿瘤转移。同时纤连蛋白介导的外泌体与骨髓瘤细胞的结合能激活p38以及pERK的信号传导，并激活下游的靶基因DKK1和MMP-9(促进骨髓瘤进展的两种分子)的表达[19]。来自肾癌细胞的CD105阳性的外泌体可以通过上调MMP2、MMP9和VEGFR1，在SCID小鼠肺细胞中形成转移前位，提示肾癌细胞来源的外泌体能够促进肿瘤的肺转移[38]。另外，肿瘤来源的外泌体还可以通过触发免疫抑制反应来调节免疫系统，这也有利于肿瘤进展[39]。在肺癌细胞释放的外泌体中，miRNA可使巨噬细胞中与Toll样受体(TLR)家族相关的转录物沉默，这种机制有利于刺激巨噬细胞分泌促炎细胞因子，增加肿瘤细胞的侵袭性[40]。

2.3 促进肿瘤耐药

目前认为肿瘤耐药的产生是一个多因素过程，包括药物外流增加、药物失活、药物靶点改变以及细胞凋亡的抑制等[41]。外泌体在癌细胞之间传递蛋白质及miRNA而产生化疗耐药[42]，并且发现其主要通过以下4个方面介导耐药产生：①增加化疗药物的外排，或将药物包裹以保护自身免受细胞毒性损害。细胞膜上的转运蛋白可以介导化疗药物排出细胞外，而药物外流的增加主要与ABC转运蛋白(如P-gp)以及多药耐药蛋白的表达上调有关[43]。LV等[44]研究发现，化疗耐药的乳腺癌细胞能通过外泌体将P-gp传递给敏感细胞，从而使敏感细胞发生化疗耐药。同时在前列腺癌研究中发现，通过外泌体转移多药耐药蛋白-1(MDR-1/ P-gp)可以使前列腺癌细胞产生对多西他赛的耐药性[42]。②通过自身携带的蛋白质或核酸诱导受体细胞产生耐药。肿瘤来源的外泌体具有水平转移耐药的能力，可以将耐药性传递给敏感细胞，从而产生新的耐药细胞。当将某些来自乳腺癌耐药细胞的外泌体中的miRNA(miR-100、miR-222、miR-30a以及miR-17)转移至敏感细胞时，可以赋予敏感细胞耐药性。而肿瘤的耐药性部分归因于肿瘤源性的外泌体传递的miRNA种类。阿霉素耐药的乳腺癌细胞通过分泌携带与Wnt信号通路相关miRNA的外泌体，激活Wnt信号通路，从而增强靶细胞的致瘤性及化疗抵抗[27]。③通过免疫逃逸避免细胞毒性药物的损害。有报道显示肿瘤源性外泌体携带的TGF-β能改变细胞对IL-2的反应，使其逃脱免疫系统监管及细胞毒性药物杀伤作用[45]。细胞内过量补体可以使细胞膜溶解，导致细胞死亡。而PILZER等[46]发现外泌体携带的mortalin/GRP75蛋白，可以促进自身载有补体MAC的外泌体脱落，并保护细胞免于补体介导的裂解，而产生化疗耐药。淋巴瘤来源的外泌体含有CD20，并且可以与治疗性的抗CD20抗体结合，从而保护靶细胞免受抗体损害，增加治疗抗性。④外泌体还可以通过增强自噬及抑制凋亡的途径诱导靶细胞产生化疗耐药。如前所述，乙酰肝素酶在骨髓瘤组织中表达上调。研究发现当敲除小鼠细胞中的乙酰肝素酶后，自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达下降。经抗肿瘤治疗后外泌体内的乙酰肝素酶增多，通过外泌体转移至靶细胞并使靶细胞的自噬增强，可以促进肿瘤生长和化疗耐药[47]。类风湿关节炎产生的外泌体被抗CD3激活的T细胞有效摄取后，可以激活AKT和NF-κB，并且使这些激活的T细胞对细胞凋亡具有抗性，从而抑制细胞凋亡而增加治疗耐药。

胃癌是世界上第四大常见恶性肿瘤，在肿瘤相关性死因中排第二位[48]。因为胃癌的早期症状不明显，早期检出率低，导致其在发现时一般为晚期。因此化疗是胃癌治疗的主要手段。氟尿嘧啶类、铂类及紫杉类药物是胃癌化疗的基础用药，而这些药物的耐药问题尤为突出。研究证实，多种细胞释放的外泌体及肿瘤微环境中外泌体的传递可以参与调控胃癌细胞的耐药。肿瘤源性的外泌体能稳定携带miRNA并转移到靶细胞中，使靶细胞中多药耐药相关蛋白的表达增加。JI等[13]证实，间充质干细胞(MSCs)来源的外泌体与受体细胞结合后能够激活GaM-K，从而触发下游的Raf/MEK/ERK级联蛋白，使多药耐药蛋白(MDR、MRP、LRP)上调，从而引起胃癌细胞对5-FU的化疗耐药。并且MSCs来源的外泌体还可以携带P-gp/MDR蛋白，促进化疗药物的外流增加。已经证实在多种类型的癌症中miR-21的上调与上皮-间充质转化(EMT)增加呈正相关。ZHENG等[14]发现，外泌体中的miR-21可以直接从巨噬细胞转移到胃癌细胞中，并通过下调PTNE抑制细胞凋亡，增强PI3K/AKT信号通路的活化，最终导致胃癌细胞对DDP的耐药。

3 结语

尽管外泌体在肿瘤相关领域的研究已经开展，也证实其在肿瘤的发生、发展、耐药等方面发挥重要作用，但是我们需要更详细的分子机制来明确它们的内在联系。已经有研究表明外泌体在乳腺癌、非小细胞肺癌和前列腺癌的化疗耐药方面起着重要作用。但在胃癌耐药方面，由于相关研究较少，还需要更多的理论数据来支持这一观点。总体来说，外泌体对肿瘤起促进作用，如果针对外泌体的产生和释放进行调节，不仅为提高肿瘤的化疗疗效提供了新靶点，也为肿瘤精准治疗的发展提供了新思路。