循环肿瘤DNA在恶性肿瘤早期诊断和预后的研究进展*

蔡一丹，易 帆 综述，谢小兵 审校

1.湖南中医药大学医学院,湖南长沙 410208;2.湖南航天医院检验科，湖南长沙 410205； 3.湖南中医药大学第一附属医院检验与病理中心，湖南长沙 410007

随着人们生活水平提高和寿命的延长，癌症成为威胁人类健康的主要疾病之一，肿瘤的检测和治疗也成为人类面临的世界性医学难题。已有的检测方法有的检出率较低，有的存在侵入性伤害，具有一定的局限性[1]。寻求一种非侵入性检测方法，对恶性肿瘤进行早期筛查、诊断以便早发现、早治疗，是研究人员一直不断努力的方向。循环肿瘤DNA(ctDNA)分子检测作为新一代体液活检技术，由于具有微创、信息全、可重复性等优势，近年来受到肿瘤生物学和肿瘤临床医学工作者的重视。本文就近年来关于ctDNA的生物学特征、检测方法及在常见恶性肿瘤临床中的早期诊断、预后评估及用药指导方面的研究进展进行综述。

1 ctDNA的发现和生物学特征

ctDNA是肿瘤患者血液中游离的来自肿瘤细胞的DNA。健康人体中均存在一类细胞游离DNA(cfDNA)，它们是可以存在于血液或其他体液中并游离于细胞之外。通常血液中的cfDNA主要由坏死和凋亡后的白细胞释放入血液中，在某些疾病(如心肌梗死、冠心病)及特殊状态下(如急性剧烈运动、妊娠)，其他细胞也会释放cfDNA入血液。MANDEL等[2]于1948年首次报道了健康个体外周血中存在cfDNA。LEON等[3]1977年发现肿瘤患者血清中cfDNA的水平显著升高。10多年后，VASIOUKHIN等[4]和SORENSON等[5]相继在急性髓性淋巴瘤、骨髓增生异常综合征和胰腺癌患者外周血cfDNA 中发现了ras基因的突变，科学工作者将从肿瘤细胞脱落释放入体液中的一类cfDNA称为ctDNA。有研究发现，肿瘤患者无论其处于肿瘤进展的哪个阶段、何种类型的实体瘤均存在ctDNA水平的显著升高，并证实随着肿瘤的进展，ctDNA的水平不断升高[6-7]。然而，ctDNA释放到血液中是随机过程还是经过某种特定生物学程序加工后再释放，仍是肿瘤生物学中一个有争论的课题[8]。

ctDNA中常包含有突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常及甲基化等相关DNA突变信息[9]。ctDNA片段一般为166 bp的核酸序列，其半衰期为16 min至2 h不等。由于血浆中存在核酸酶，单独以DNA形式存在的ctDNA片段大多易被降解，ctDNA大多以DNA和蛋白质结合形成DNA-蛋白质复合体的形式存在。健康人体在免疫系统特别是巨噬细胞的吞噬和溶酶体的清除作用下，血液中的ctDNA水平较低。肿瘤患者ctDNA水平显著升高，一方面机体肿瘤细胞在以指数方式倍增，肿瘤细胞的代谢、凋亡和坏死的量及释放进入血液的循环肿瘤细胞也以同样的方式倍增，循环肿瘤细胞播散及坏死释放的DNA超出了机体正常的清除能力；另一方面，肿瘤患者机体免疫系统的功能大多异常，导致肿瘤患者血液ctDNA显著升高。有研究表明，健康人血液中cfDNA水平多为1～100 μg/L，而肿瘤患者血液中ctDNA 浓度可达1 000 μg/L，平均为180 μg/L[10]。

2 ctDNA的检测方法

肿瘤是一种由于体细胞的基因异常产生的病变，这些突变的体细胞DNA，只存在于癌前细胞或癌细胞基因组中，同一机体的其他正常细胞基因组则不会出现，这保证了ctDNA 能以特有的生物特异性成为肿瘤诊断的生物标志物。因此，理论上所有用于鉴定体细胞DNA变异的分子生物学技术都可以用于ctDNA的检测。然而，由于体液中ctDNA水平非常低，通常ctDNA只有cfDNA的0.01%～1.00%，常规基因测序技术如Sanger法、焦磷酸测序只能用于高负荷肿瘤检测或是高丰度ctDNA突变片段分析，使其推广和临床应用受到了极大限制。近年来，随着DNA 测序技术和分子诊断技术的快速发展，对痕量DNA 分子进行定量分析已经有了多种选择。当前常用的可用于ctDNA检测和分析技术有第二代的高通量测序法(NGS)、磁珠捕获法(BEAMing)[11]、微滴式数字PCR技术[12](ddPCR)、低温变性下复合PCR技术(cold-PCR)[13]。

2.1NGS NGS技术具有通量高、检测速度快、成本较低等优点，被广泛应用于各种体液标本DNA的分析。NGS主要包括DNA连接，DNA文库构建，克隆模板扩增和大规模平行测序。NGS平台可执行大规模的DNA并行测序，以实现对来自样品的数百万个DNA片段进行统一测序和对未知突变的筛查，并分析基因的遗传多态性。NGS技术的应用主要有两个：一是进行基因组靶序列捕获测序，设计合适的芯片探针，可实现对一个或多个已知致病基因进行测序；二是进行全外显子组测序或全基因组测序，前者可用于研究基因组的蛋白编码区域，从而揭示对疾病和群体健康的遗传影响，后者可对不同个体或者是群体进行全基因组序列分析和生物信息学分析，可全面挖掘基因组的各类变异[14]。

2.2BEAMing BEAMing 技术是利用磁珠来吸附游离DNA，其探针是一条序列已知的单链固定在固相(芯片、微珠)表面，另一条样品中的单链来与其杂交配对。它可以从数万个正常细胞DNA中检测出有基因突变的ctDNA 分子。GARCIA等[15]对183例已知EGFR突变的非小细胞肺癌患者，分别采用BEAMing和NGS方法检测患者ctDNA中T790M EGFR基因突变，检测阳性率分别为21.8%和10.9%。

2.3ddPCR ddPCR技术是先将DNA链模板稀释到单个模板分子并分配到大量独立的反应单元中，即先对标本微滴化处理，再进行PCR扩增，扩增结束后对每个独立反应室荧光信号进行统计学分析，最后定量DNA拷贝数。ddPCR不依赖扩增的循环阈值(Ct)，不需内参和标准曲线，具有准确度高、重现性好和绝对定量分析等优点[16]。ddPCR和优化的NGS在ctDNA分析中也各有优缺点。与NGS相比，ddPCR实验更容易建立，速度更快，敏感度更高，分析不需要复杂的信息学支持。BETTEGOWDA等[17]报道，采用ddPCR技术，超过80%的晚期结直肠癌、黑色素瘤和胰腺癌患者中可以检测到血浆ctDNA中与癌症相关的热点基因突变。与此类似，VESSIES等[18]也在黑色素瘤、结直肠癌、肺癌和胰腺癌中检测到血浆ctDNA中相关基因的突变。

2.4cold-PCR cold-PCR技术是在高丰度野生型DNA片段背景下选择性变性并扩增低丰度突变型DNA片段序列的方法，cold-PCR技术可将突变型序列富集10～100倍。基于突变片段Tm值的改变和异源双链DNA分子的形成，cold-PCR可富集扩增片段中所有类型和位置的突变，也可富集未知突变，具有敏感高、特异性强、精确度高、低成本和易操作等优点[19-20]。SEFRIOUI等[21]采用ddPCR技术和cold-PCR技术定量分析了29例结直肠癌患者血清ctDNA中Kras基因突变，发现cold-PCR可以准确地检测和量化ctDNA的低丰度基因突变，在保证定量分析准确性的前提下可快速得出分析结果。

3 ctDNA在恶性肿瘤临床应用中的进展

由于ctDNA中包含患者肿瘤的全部遗传学信息，利用ctDNA做为肿瘤标志物，分析其突变、缺失、插入、倒位及甲基化等表观遗传学改变，在肿瘤的早期筛查、预后以及用药指导等各方面可以发挥重要作用。

3.1ctDNA作为恶性肿瘤早期诊断的生物标志 近年来，关于疾病生物标志物的研究一直是临床医学研究的热点、重点和难点。特别是精准医疗的概念提出后，肿瘤生物标志物相关研究计划被列入了国家“973”计划、国家重点研发计划、科技部重大专项计划等[22]。这些生物标志物是疾病复发、进展或预后评估中的指示因子。来自肿瘤的ctDNA能在一定程度上代表肿瘤的整个基因组格局，并且可以用作液体活检来分析肿瘤特异性遗传和表观遗传学改变，包括癌基因或抑癌基因的突变、甲基化及基因扩增等。在过去的几年中，ctDNA作为有效且可靠的生物标志，在对特定患者进行分型，指导临床早期诊断和治疗及预后的评估中发挥了关键作用。利用ctDNA生物标志，早期检测特定类型癌症的表观遗传学异常，如癌基因或者抑癌基因中启动子的低甲基化，可以为肿瘤生物学研究和临床治疗提供重要信息。多项研究表明，在肝癌患者外周血ctDNA中，常见TP53[23]、ITH[24]、HCK[25]和TNNB1[26]存在特异性突变，提示可以检测患者外周血ctDNA来早期诊断肝细胞癌变。GORMALLY等[27]报道了检测血浆ctDNA，最早可以提前2年发现健康受试者的Kras基因突变，提前在癌症诊断之前的20.8个月发现健康患者TP53的突变。早期肿瘤或肿瘤微转移的晚期患者虽然血浆中只含有较低丰度的ctDNA片段，但是随着DNA检测技术的不断进步，对痕量DNA定量定性分析也成为可能[28]。

3.2ctDNA在恶性肿瘤预后评估中的作用 临床医生根据影像和组织标本检测中得到的信息，结合临床观察、肿瘤进展分期、组织病理学改变和生物分子特征等可以对不同癌症患者的预后进行评估。当组织切片不易获得(如非实体瘤)，或者保存的组织切片基因分析遇到困难，利用患者血液检测ctDNA的重要性就得到显现。BETTEGOWDA等[17]的研究表明，ctDNA 可在超过75% 的非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、结直肠癌、肝癌及头颈癌中检测到。已有研究证明，ctDNA具有一系列与肿瘤相关的分子生物学特征：ras 基因及TP53基因的突变，p14、p16、APC基因过甲基化，等位基因杂合性缺失(LOH)及mtDNA 改变等现象[29]。非小细胞肺癌(NSCLC)患者中，大约1/3都有Kras基因突变，GAUTSCHI等[30]研究了180 例肺癌患者ctDNA 发现Kras突变与患者预后不良有关。PARKINSON 等[31]对40例恶性复发性高级别浆液性卵巢癌患者TP53基因ctDNA突变情况分析，显示在化疗1个疗程后，TP53突变等位基因分数下降>60%的患者有更长的无复发生存期。MORIKAWA等[32]对卵巢透明细胞癌患者血浆PIK3CA和Kras基因ctDNA检测结果显示，细胞高水平PIK3CA-H1047R或KRAS-G12D 的ctDNA患者有更短的生存期。一系列的研究表明，胰腺癌患者血浆ctDNA含有Kras基因突变并且Kras基因的突变可以用来监测胰腺癌的发展[33-34]。DABRITZ等[35]检测了56例胰导管腺癌患者及13例胰腺炎患者血浆ctDNA中Kras基因突变，胰导管腺癌中检测到20例患者的Kras基因有突变，而在胰腺炎患者中均无Kras基因的突变。在结肠直肠癌的研究方面，TROJAN等[36]比较了37例结直肠癌患者血液ctDNA中Kras基因突变及CDKN2A启动子的超甲基化情况，发现Kras基因有突变和(或)CDKN2A启动子有超甲基化的患者，其2年生存率为48%，而二者没有发生改变的患者，其2年生存率为100%。

3.3ctDNA在恶性肿瘤治疗中用药指导作用 近年来，肿瘤药物在传统的放疗、化疗的药物基础上呈现多样化、个性化和精准化的趋势，选择安全、疗效可靠的药物是肿瘤临床治疗面临的重要挑战。作为一种生物标志，患者外周血中ctDNA水平及不同类型肿瘤相关基因的变异特征都能有效反映肿瘤的变化，ctDNA检测在肿瘤手术治疗或者药物治疗后疗效评估中显示出了其诱人的应用潜力。

有研究表明，晚期结直肠癌患者ctDNA检测分析能反映肿瘤进展状况及术后预后评估，也能指导靶向药物的治疗方案及寻找耐药发生机制，通过检测Kras基因野生型和突变型来研究晚期结肠癌EGFR 阻断剂耐药突变的出现[37]，对可能产生的耐药位点基因突变进行检测，并追踪耐药突变基因。BETTEGOWDA等[17]对晚期结肠癌患者Kras、BRAF、NRAS、EGFR和PIK3CA的所有外显子进行分析，发现96%的晚期结肠癌患者的Kras或NRAS基因至少一个有突变。可见血浆ctDNA检测对卵巢癌患者药物选择及药物耐药的预测能起到临床用药指导作用。

4 基于ctDNA检测的肿瘤精准医疗在临床应用中存在的问题和未来发展趋势

4.1ctDNA检测在肿瘤临床应用中存在的问题

4.1.1研究的样本量有限，限制了ctDNA在临床的广泛应用 尽管已有研究显示，血浆ctDNA 与恶性肿瘤组织基因突变有高度一致性，但目前的研究大多处于实验室研究阶段，研究的样本量较少，因此在恶性肿瘤患者中，血浆ctDNA检测能否完全取代肿瘤组织的基因检测从而进一步指导临床诊断、治疗和用药仍需进一步的、前瞻性的临床研究证实。

4.1.2检测方法和观察指标的稳定性、标准化还需要进一步提高 目前血浆ctDNA 检测方法有多种实验技术，各种恶性肿瘤血浆ctDNA检测观察指标不一，各种监测技术及观察指标如何更加敏感、稳定、标准化地应用于评估肿瘤发生、发展的进程，仍需大规模、大样本的临床研究验证。

4.2ctDNA检测技术在肿瘤临床应用中的发展趋势 随着肿瘤生物学、分子生物学及基因工程技术研究的不断深入，以及转化医学的迅速发展，ctDNA 在恶性肿瘤诊疗过程中的作用将不断受到重视。ctDNA检测的快速、简便、经济、侵害性小、实时动态佳等优势受到越来越多的科研工作者和临床医学工作者的关注。基于肿瘤患者血液ctDNA的监测策略将更全面、动态地反映肿瘤进展的演变过程，显示肿瘤在早期诊断、预后、临床用药指导的价值。人类基因检测技术的发展为肿瘤精准医疗提供了技术支撑。目前，基于NGS、BEAMing、ddPCR及cold-PCR技术等基因测量技术的发展，对基因的表达分析和检测更加精准，为肿瘤的分型和精准治疗提供了技术援助，随着这些检测技术的进步和更新，检测成本的不断降低，对肿瘤精准治疗的实施将成为现实。