蛋白多肽类药物和单抗药物免疫原性评价方法及研究进展

王慧敏，闻镍，王晓霞，刘丽，刘会芳

·综述·

蛋白多肽类药物和单抗药物免疫原性评价方法及研究进展

王慧敏，闻镍，王晓霞，刘丽，刘会芳

071028 保定，河北大学药学院（王慧敏、刘会芳）；100176 北京，中国食品药品检定研究院国家药物安全评价监测中心药物非临床安全评价研究北京市重点实验室（闻镍、王晓霞、刘丽）

免疫原性是指药物刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的性质[1]。许多生物药物在体内都具有免疫原性，对动物或人给予蛋白多肽类药物或单克隆抗体（简称单抗）药物后可能会引起机体产生抗药物抗体（anti-drug antibody，ADA）。ADA 会对药物暴露、药物代谢动力学特征、药效、药物毒性作用等造成影响，主要包括：ADA 与药物结合，可能增加或减少药物的清除、影响血浆半衰期和组织分布、改变药物的暴露水平和药代动力学特征；ADA 降低药物暴露水平可能使非临床毒理研究中药物毒性作用被部分掩盖，影响对药物毒性作用的评价及对临床研究中起始剂量的评估；中和抗体（neutralizing antibody，NAb）会中和药物的活性，降低药物的药效作用；ADA 与药物及内源性同系蛋白结合后，可能会导致该蛋白缺陷综合征，引起相应毒性作用；对药物的免疫应答可能会导致过敏反应、自身免疫等，ADA-药物免疫复合物沉积可能引起免疫病理变化和相关不良反应。因此，在非临床药代动力学、药理和毒理研究中评价免疫原性有助于对研究结果作出更加合理的解释，是生物药申报临床试验的重要内容。同样，免疫原性评价也是蛋白多肽类药物和单抗药物临床研究中重要的评价项目，是监管部门关注的重要内容。在生物类似药物研发中，也是进行相似性比对的主要指标之一。EMA、FDA、NMPA 相关技术指导原则中都要求检测此类药物的免疫原性，检测的要求越来越严。

蛋白多肽类和单抗药物免疫原性评价主要包括判定 ADA 的存在与否、ADA 水平（抗体滴度）、是否具有中和能力、抗体产生比例和发展变化情况等。有多种方法和技术可用于 ADA 检测。蛋白多肽类和单抗药物由于给药剂量大、半衰期长，循环中的高浓度药物给免疫原性的评估带来了很大挑战。另外，可溶性靶标的存在也会给单抗药物免疫原性检测带来较大干扰。如何减少这些干扰，保证检测结果的准确性、灵敏度、特异性和可靠性是当前 ADA 和 NAb 检测方法亟需解决的问题。本文对常用的 ADA 和 NAb 检测方法、检测中存在的问题、已有解决方法及其研究进展进行综述，为蛋白多肽类药物和单抗药物研究开发和应用中免疫原性的评价提供方法参考。

1 ADA 的检测

ADA 的检测和表征常采用多层次方法。检测通常包括筛选试验和特异性确证试验；表征试验一般包括抗体滴度测定、亚型测定和中和抗体检测。

ADA 检测试验需要两个关键的决策参数，分别为筛选临界点和特异性临界点[2]。筛选临界点即筛选试验中判断样品为阴性或阳性的响应水平[3]，等于或高于筛选临界点的样品为阳性样品。相反地，若低于筛选临界点，则判断该样品为阴性样品。一个有效的筛选临界点需要在预研究验证阶段对一系列样品测定值进行系统性的统计分析，然后才能确定。一般情况下，一定比例的假阳性结果比没有假阳性结果好，可以允许约 5% 的筛选试验阳性结果为假阳性，以保证可以检测出弱阳性样品。同时，要求所使用的样品可代表使用目标群体或受试者。特异性临界点是可以区别抗药抗体与药物是否特异性结合的值，其有效性非常关键，必须客观评估。不建议使用 50% 信号抑制等主观标准，信号略高于临界点的抗药抗体弱阳性样品的评价尤为重要。

抗药抗体的表征试验中抗体滴度的测定，一般表示为，能够产生阳性结果的最低浓度，或者说最大稀释倍数；亚型测定即检测抗药抗体所属 IgA、IgD、IgE、IgG 以及 IgM 中的哪一种亚型；中和抗体的检测即为检测 ADA 中是否有可以中和药物活性的抗体。

1.1 ADA 检测分析方法

1.1.1 ADA 检测常用分析方法 常用方法包括酶联免疫法（ELISA）、放射免疫沉淀法（RIPA）、表面等离子体共振法（SPR）、电化学发光法（ECL）、全自动纳升级免疫分析工作站（Gyrolab）等。

免疫原性筛选通常使用操作方便快捷、能够高通量测定的 ELISA 方法。桥式 ELISA 方法最为常用，该方法是利用包被在酶标板上的抗体药物捕获血清样品中的 ADA，然后加入生物素标记的抗体药物，使其与 ADA 结合。接着用链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联试剂作为检测试剂，加入酶反应底物显色后，再利用酶标仪进行检测。此法的优点是能检测各类抗体的亚型，可高通量检测。但此法不易检测到低亲和力的抗体，在包被或标记药物时可能会掩盖或者改变药物的抗原表位，而且检测时也容易受到药物本身的干扰[4-5]。

RIPA 法是以放射性标记的抗原或抗体通过免疫沉淀检测 ADA。优点是中等或高通量水平，通常灵敏度高、特异性强、操作简便、样品及试剂用量少。但缺点是该方法中标记抗原的比活度和放化纯度必须足够高，而且所使用放射性同位素的半衰期也必须足够长，否则有部分抗体无法被检测到，导致定量不准。而且同位素具有潜在放射性危害，同位素标记还会影响表位的暴露，标记药物非特异性地夹带在沉淀物中，相对于固相表面，结合力较弱。

SPR 技术是将药物偶联在传感器芯片上，其可与样品中的抗药抗体结合[6]，使传感器能够间接检测到抗药抗体，最后通过系统拟合的结合曲线对 ADA 进行定量分析。该方法的优点是可实现实时、无标记检测，而且快速、灵敏、操作简便，能检测到不同亲和力的抗体和各抗体亚型；缺点是所用试剂通用性差，通量低。

ECL 是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，可用磁珠或者石墨电极板作为反应载体。将生物素标记的药物与链霉亲和素包被的微磁珠或石墨电极板相结合，利用该药物去捕获样品中的 ADA，然后再加入钌标记的药物，使其与 ADA结合。形成免疫复合物后，以磁珠为载体的试验利用磁场吸附磁珠，并用 ProCell（在免疫分析系统中产生电化学信号的系统溶液）溶液将结合了磁珠的免疫复合物与未结合的组分分离，最后施加电压启动反应，激发钌发出光信号，通过采集光信号，并将光信号转化成 ADA 浓度，得以实现对 ADA 的定量。而以石墨电极板作为反应载体的试验，将电极表面通电后，通过电化学作用激发钌标记物发出强光，同样通过检测光信号进行 ADA 的定量[7]。ECL 法精密度高、灵敏度高、线性范围宽、检测时间短、反应体系可控、样品用量少、通量高，缺点是需制备 2 种标记物（生物素标记的药物和钌标记的药物），需要保证标记物足够稳定，所用试剂通用性差。

使用 Gyrolab 平台进行免疫原性检测，采用自动化进样方式，将传统的双抗夹心大分子检测方法与微流控 CD 技术结合在一起，CD 微结构中装有链霉亲和素包裹的微珠填料，通过生物素捕捉试剂，与样本特异性相结合，再与带荧光团的检测试剂结合，用工作站中的激光激发荧光，并用检测器对吸附在样本上的荧光标记物进行读数。该技术已经被广泛用于生物分析中的配体结合试验[8]。该技术的优点是自动化、通量高、节省时间、试剂盒样品用量少、检测范围广、基质效应低。专用的 Gyrolab ADA 软件还可以帮助确定筛选临界点和确证临界点。

1.1.2 ADA 检测新兴分析技术 为满足越来越严格的评价标准的要求，涌现出一些新兴ADA 检测分析技术。

免疫 PCR 法（Im-PCR），首先将 ADA 与固相上的药物及生物素化药物结合，从而形成“药物-ADA-生物素化药物”的桥梁，然后加入抗生物素-DNA 复合物作为检测试剂，通过扩增 DNA，间接对 ADA 进行检测[9-10]。该方法也是在 ELISA 的基础上建立起的，用 PCR 扩增代替 ELISA 的酶催化底物显色[11]。PCR 具有很强的放大能力，可以检测稀释后的 ADA，不仅可减少基质效应，还具有非常高的灵敏度和特异性。与对应的 ELISA 比较，Im-PCR 可使 ADA 检测的灵敏度提高约 1000 倍，而且本法中仅仅采用稀释的方法就可以消除生物样品中基质的干扰[11]。

Singulex Erenna 是基于单分子检测技术（SMC）的免疫检测系统，原理与传统的 ELISA 很相似，只是在捕获和检测步骤，药物将每个 ADA 转化成信号。在洗脱步骤，荧光素标记的检测抗体从免疫复合物中解离下来，洗脱物被送入 Erenna 系统的毛细管中，毛细管上有一个非常微小的检测空间可供激光照射。通过检测空间时，单个的荧光素标记抗体可以产生荧光闪烁，从而被检测到。SMC 技术在获得最优化的免疫检测效力的同时，操作流程相对更为简便，该技术通过整合独特的洗脱步骤和灵敏的数字化检测，相较于传统免疫检测技术，信噪比有了很显著的改善，实现了可以在一个系统里同时检测低水平和高水平的 ADA。

SQI SquidLite 技术可以在活化的玻璃表面上打印药物的微阵列斑点[12]，加入待测样品后，ADA 就会与药物结合，再用荧光标记的抗体结合 ADA，通过检测荧光强度对 ADA 进行分析。该平台实现了在同一孔中进行 ADA 及其亚型的检测，可以避免多次检测带来的样本量的损耗。该技术与 ELISA 或 ECL 相比，有更高的敏感性和耐药性。它的主要优势体现在，当需要进行检测抗体分型时能够多路复用，自动化系统还具有高通量特性。然而该平台使用专用缓冲器，前期需要大量成本。

Genalyte Maverick 系统也可以实现同时检测 ADA 及其亚型。该技术平台，将药物捕获探针印刷在硅光子生物传感器表面，样品中的 ADA 会被药物捕获，使用结合在链霉亲和素包被珠上的生物素化药进行检测，由于珠子的加入改变了原样品溶液的折射率，然后根据折射率的变化，就可以测定 ADA[8]。该系统能够检测所有免疫球蛋白亚型，包括单价的 IgG4。然而该平台要求样品进行酸解离预处理，然后用包被在 96 孔板上的药物亲和捕获 ADA，ADA 要在低 pH 下洗脱和中和。SQI SquidLite 技术和Genalyte Maverick 系统均有可自动化的优势，但是后者不需要标记，而且可以进行实时动态读取结果，而前者只有最终的结果读数，并且目前使用较少。

1.2 ADA 检测中主要干扰因素及解决方法

1.2.1 样品基质中循环药物的干扰及解决方法 免疫原性检测，会受到样品基质中循环药物的干扰，过量的药物与 ADA 结合，会造成 ADA 检测假阴性结果。目前 ADA 分析中有多种方法来提高药物耐受性，减少或避免由于游离药物的存在造成的假阴性结果，防止对 ADA 的低估。

由于 ADA 在样品中会有两种存在形式，即游离ADA 和ADA-药物复合物[13]。游离的ADA 相对比较容易检测到，想要同时检测与药物结合的 ADA，单独利用上述某一种方法或技术平台难以实现。为了克服 ADA 检测过程中受到的各种干扰，需要对样品进行预处理，目前主要的预处理方法有吸附小柱去除游离药物、酸解离或碱解离（绝大多数情况下为酸解离）、磁珠提取和酸解离（BEAD）、固相提取和酸解离（SPEAD）等方法。

1.2.1.1 吸附小柱去除游离药物 吸附小柱可与药物特异性结合的物质（抗人 IgG 单克隆抗体或多克隆抗体）与固相载体（琼脂糖树脂、磁性颗粒、芯片或微流体）偶联，该物质不与样品中除游离药物之外的其他成分反应，可特异性地结合待测样品中的游离药物，可以使其后的 ADA 检测中（如使用桥接 ELISA 法）避免游离药物与标记试剂竞争结合待检测的 ADA 所致的干扰，包括对 ADA 检测的低估或假阴性结果[14]。这个方法不仅有效地减少了药物对抗药抗体检测的干扰，同时还提高了检测灵敏度。但该方法只是去除样品中游离的药物，而已经与 ADA 结合的药物难以去除，药物-ADA 复合物依旧会影响检测结果。

1.2.1.2 酸解离 酸解离是较为常见的预处理手段[5]。具体地说，酸解离是通过酸化样品来实现将 ADA-药物复合物解离成 ADA 和药物，但这仅是在酸性条件下的存在形式，酸化后的样品需要在 pH 回到中性时方可被用于 ADA 的检测。此时，样品中的部分药物和抗药抗体又重新形成 ADA-药物复合物。而且，酸处理可以分解药物-靶点复合物，可能会将游离靶点释放到样品基质中，导致假阳性结果。但酸解离的最大目的是使得原来已与药物结合的抗药抗体至少有部分可以被检测到，如果不采用酸解的话，可能检测不到 ADA。在使用酸解离处理样品的 ECL 检测方法中，即使酸化后样品中的抗药抗体在中性 pH 条件下，仅仅只有部分会同时与电极板微孔中生物素化的药物以及钌标记的药物结合，但仍然可被检测出来。在所用酸解试剂不影响 ADA 性质的前提下，此方法简单，易操作。

1.2.1.3 BEAD 和 SPEAD BEAD 法与 SPEAD 法原理相似，两者均是在载体上包被链霉亲和素以结合生物素-药物偶联物，差别在于 BEAD 法提取 ADA 的载体是磁珠，SPEAD 法提取 ADA 的载体是链霉亲和素包被的石墨电极板或酶标板[15-18]。在这两种方法中，药物-ADA 复合物在低 pH 条件下解离，当溶液中和后，加入生物素-药物偶联物，与游离药物竞争结合 ADA，生物素-药物偶联物与 ADA 结合后被捕获在链霉亲和素包被的载体（磁珠或板）上。捕获的 ADA 再次在低 pH 条件下处理洗脱，然后进行检测。相对而言，SPEAD 法具有操作简单和材料价格较低的优势，但与磁珠相比，板的结合能力相对较低。根据本实验室经验，同样条件下，BEAD 法得到的检测结果相对稳定，易重复。

1.2.1.4 沉淀和酸解离 Zoghbi 等[19]开发了一种突破性的新方法，即采用沉淀和酸解离（PandA）相结合的方法来克服 ADA 检测中的药物干扰。该方法的原理是将过量的药物添加到含 ADA 的血清样品中并孵育，以形成 ADA-药物复合物。初次孵育后，在样品中添加 PEG 并孵育以使复合物沉淀。对沉淀进行一系列洗涤，最后一次洗涤后，将沉淀用乙酸解离，使 ADA-药物复合物解离成 ADA 和药物，并直接包被到石墨电极板上。孵育后，将板封闭，然后加入钌标记的药物与包被的 ADA 结合，通过 ECL 方法对 ADA 进行检测。在他们的方法中，分别使用了人源化 IgG1、全人源 IgG4 和人源化 IgG4 单抗药物进行实验，均证明了该方法的适用性。然而本实验室在实际应用该方法时发现，由于操作步骤较多，分离沉淀和上清液难度也较大，而 PEG 的浓度也会影响灵敏度和特异性，因此不确定因素较多，导致重复性较差。

1.2.2 基质中可溶性靶标的干扰及解决方法 对于单抗药物，可溶性靶标的干扰也是一个特别具有挑战性的问题。可溶性的二聚体或多聚体药物靶标可以在两个标记药物分子之间形成桥梁，容易导致 ADA 假阳性结果。

单克隆抗体药物 ADA 检测中，对于可溶性靶标的干扰问题，目前通常采用的解决方法是将基质中的可溶性靶点进行清除，通常可以用靶点抑制剂（一般为相应的抗靶点抗体）去结合靶点，可去除靶点的干扰作用，提高靶点耐受性[20]。

1.2.3 基质中类风湿因子的干扰及解决办法 类风湿因子（RF）是以变性的 IgG 的 Fc 片段为靶抗原的自身抗体，RF 不仅可与变性的 IgG 结合，也与自身 IgG 或异体 IgG 反应，常对免疫检测造成干扰。在检测 ADA 时，如果用的捕获抗体和检测抗体均为 IgG，样本基质中的 RF 能同时与二者结合，形成捕获抗体-RF-检测抗体复合物，从而产生 ADA 假阳性。而当 RF 只能与其中一种抗体结合时，又会造成空间位阻，导致假阴性结果的产生。对于存在 RF 干扰的样本，可通过对样本进行前处理以消除或尽可能降低其干扰。常用的方法包括：分析前在样本中加入动物血清或 IgG，或加入封闭阻断试剂；用包被 IgG 的固体颗粒吸附；使用阻断试管采集样本等[21]。

前文所述的检测方法和平台多数都较为传统，通常都是在前处理过程中将 ADA-药物复合物分开，然后单独检测 ADA。是否可以实现在 ADA-药物复合物不分开的情况下检测 ADA，值得进一步探究。

2 NAb 的检测

药物的中和抗体指能够中和药物活性的抗药抗体，单抗药物的中和抗体是与单抗互补决定区（CDR）特异性结合的抗药抗体[22]。在某些情况下，NAb 还可以与内源性对应物发生交叉反应，从而导致一些正常生理功能受损和危及生命的副作用。因此 NAb 的表征已经成为评估生物技术药物安全性和有效性的重要要素。

2.1 NAb 检测方法

NAb 检测通常分为两类：基于细胞的分析检测（CBA）和竞争性配体结合分析检测（CLBA）[23]。CBA 方法使用表达药物预定靶点的细胞，样品中的 NAb 阻止了药物与其靶点结合产生的细胞效应，从而根据细胞效应减弱的程度进行 NAb 分析；CLBA 方法是通过评价可溶性靶点和样品中NAb 对药物的竞争性结合，再结合 ELISA 或 ECL 平台进行 NAb 检测。

对于 NAb 检测，监管机构推荐基于细胞的分析检测作为首选方法，因为细胞反应更能反映 NAb 在体内对药物的影响[3]。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）是一种常见的治疗性抗体药物的作用机制。Wu等[23]建立、优化了一种基于 ADCC 的 NAb 检测方法，用该方法来检测贝那利珠单抗给予人后诱导的 NAb。其原理是贝那珠单抗与靶细胞上的人 IL-5R 结合，并且贝那珠单抗的 Fc 区通过 CD16 与效应细胞结合，从而诱导靶细胞的 ADCC。ADCC 活性与荧光素酶报告基因的激活密切相关。在含有 NAb 的血清样品中，ADCC 就会被 NAb 抑制，导致荧光素酶信号（RLU 值）降低。产生的荧光素酶信号与样品中存在的 NAb 数量成反比。虽然该方法药物耐受性和灵敏度都不是很高，但用于检测临床样本是可行的。

美国瑞泽恩制药公司发明了用于检测中和抗体的竞争性配体结合法[24]，该方法简单来说包括以下步骤，首先要获取样品，然后在捕获试剂（一般为生物素标记的治疗性蛋白药物）存在下孵育样品，最后加入检测试剂。其中相对于对照样品降低的信号指示针对蛋白多肽或单抗药物的中和抗体存在。该方法灵敏度较高，特异性较强，动态范围较广，检测时间较短，有相对更高的药物耐受性。

Wu等[23]曾通过检测贝那利珠单抗的中和抗体对比了 CBA 与 CLBA 两种方法在检测 NAb 时精密度、灵敏度以及药物耐受性等方面的差异。CLBA 与 CBA 批内变异相当，与 CBA 相比，CLBA 批间变异相对小得多，因此 CLBA 比 CBA 精密度更高。CLBA 对单克隆ADA 阳性对照及多克隆 ADA 阳性对照的检测灵敏度也相对较高。另外，尽管两种方法的药物耐受性都是有限的，但 CLBA 药物耐受性约为 2.5倍（可检测到的 NAb 浓度与药物浓度比），而 CBA 则只有 1.6 倍，因此 CLBA 药物耐受性同样相对较高。Hu 等[25]在 3 项临床研究中也进行了 CBA 和 CLBA 法的对比，其中两项研究结果表明 CBA 和 CLBA 检测中和抗体的能力相当，在第三项研究中，CLBA 表现相对较差。由此可见，无论是 CBA 还是 CLBA，都有自身的优势和局限性，应根据每一种药物独特的作用机制、免疫风险评估以及技术可行性评估去选择和设计 NAb 检测方法。

2.2 NAb 检测中常见的干扰因素及解决办法

在 CBA 分析中，同样存在着样品基质对检测的干扰，样本基质中高浓度的循环药物可与 NAb 结合，并导致假阴性结果；样品基质中的可溶性靶点与药物结合，阻止了药物介导的细胞依赖的生物活性作用，导致产生假阳性结果。而在 CLBA 分析中，游离的可溶性靶标可以阻止标记的靶标与检测板上包被的药物结合，从而产生假阳性结果。

为了避免假性结果的出现，可采用各种方法来减轻循环药物及可溶性靶点对 NAb 分析的干扰。用于解决 ADA 检测干扰问题的预处理方法同样适用于 NAb 的检测，例如酸解离、循环药物的去除、从样品基质中分离 ADA 或使用抗靶点抗体抑制药物靶点等，但有些方法的一些步骤需要进行改进，如 SPEAD 和 BEAD 方法，以更有利于 NAb 的检测。

在 SPEAD 或 BEAD 中，在低 pH 下，链霉亲和素包被的磁珠上结合的生物素-药物结合物由于结合能力降低可能会发生一定程度的浸出，尽管通常来讲生物素-药物的浸出对 ADA 分析没有明显影响，但浸出的生物素-药物会与 NAb 结合，可能干扰 NAb 检测，影响分析结果。可通过优化所用洗脱溶液的 pH、生物素摩尔比以及孵育时间等实验条件，解决生物素-药物结合物浸出问题[15]。

3 结语

在生物技术药物的安全性和有效性的评估中，免疫原性一直是非常重要的评价内容[26]，ADA 检测方法缺乏标准化是免疫原性评价的一大问题[27]。高浓度循环药物的干扰，是当前 ADA 与 NAb 检测面临的主要问题。对于单抗药物而言，可溶性靶标也会对检测产生干扰，这些都会直接影响检测结果。目前主要的方法是进行酸解或磁珠提取等预处理，或者将不同预处理方法相结合。在研究中，应该考虑每种药物的特点、检测目的、风险评估、灵敏度目标、操作难易程度及可行性等，选择适用的分析方法和平台。

近年来，不同的免疫原性分析方法在灵敏度和耐药性方面有了大幅提高，并且在持续完善。随着免疫原性评价技术的不断进步，相信将有更加优化的方法出现，用于准确评价蛋白多肽类和单抗药物的免疫原性。

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刘会芳，Email：liu-huifang@163.com；刘丽，Email：liuli@ nifdc.org.cn

2020-10-23

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.009