内皮间质转化在肾脏纤维化中的作用

葛 婷，阮鸿娇，李金尧，胡万祥，陈志宏，宋成军

（承德医学院，河北承德 067000）

肾脏纤维化（renal fibrosis，RF）主要表现为肾小管萎缩、肾小球硬化等特征，是所有慢性肾脏病发展为终末期肾脏疾病的共同途径。因此，了解导致RF的基本机制对于开发更好的慢性肾脏病治疗方案至关重要。到目前为止，国内外对RF的发生机制多集中于肾间质成纤维细胞的活化、肾小管上皮细胞的损伤、细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的稳态和炎性细胞的浸润等方面。最新研究表明，内皮细胞（endothelial cells，ECs）发生的内皮间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndoMT）可能加速了RF，并被认为是肌成纤维细胞（myof ibroblast，MF）增殖的新机制。因此，本文就EndoMT在慢性RF中的研究进展予以综述，以期了解在RF过程中EndoMT所起的作用，为其治疗提供新的见解和思路。

1 概述

在全球范围内，慢性肾脏病的发病率和患病率急剧增长，且预后差，是继心脑血管疾病、恶性肿瘤、糖尿病之后又一严重威胁人类健康的疾病之一。有统计数据显示，截至2016年，中国成人慢性肾脏病的粗患病率为13.4%[1]，其中45%的死亡可归因于RF[2]。此外，Hoerger等[3]预测，2030年，美国30岁及以上人口中慢性肾脏病的患病人数将增至近3800万，即患病率可能达到16.7%。当慢性肾脏病进展到终末期肾脏疾病时，除肾脏移植或透析外，目前尚无有效的治疗手段。因此，慢性肾脏病已经成为一个全球公共健康问题，且带来了巨额经济负担，亟需开发新的干预措施以减缓其发生和发展。

大量数据表明，RF是导致慢性肾脏病的主要决定因素，RF的病变程度与病情预后密切相关。在各种致病因素（炎症、创伤、代谢紊乱、毒物、氧化应激、外泌体等[4]）的作用下，肾间质成纤维细胞、ECs、肾小管上皮细胞、骨髓来源的纤维细胞等都可转化为MF，而MF则是产生ECM的主要效应细胞，加速RF的进程。其中，ECs转化成MF即EndoMT现已成为国际肾脏病领域极其关注的研究热点[5,6]。

2 ECs的功能

在肾脏微血管环境中，ECs的结构高度不均一，从肾小球前小动脉到管周毛细血管床高度分化，除了具有典型的屏障作用以及构成血管内表面，在血管内稳态中起至关重要的作用外，还参与许多生理过程，包括血管舒缩张力的控制、抗凝和纤溶、血栓形成、组织炎症反应和血管重塑的调节[7]。由于ECs具有许多重要的功能，于是众多科学家开始研究慢性肾脏病的发生是否与ECs的损伤相关。目前已证实肾小球内皮细胞（glomerular endothelial cells，GEnCs）的损伤确实参与了慢性肾脏病发生的多个病理过程，尤其与RF密切相关。

GEnCs是肾小球血管网的血管内皮细胞，与足细胞及肾小球基底膜共同构成肾小球的滤过屏障，作为第一道防线，能使大分子物质不被滤过排出，在肾脏滤过功能中起关键作用。此外，GEnCs还可与足细胞和系膜细胞相互作用，并受到源自这些细胞的关键血管生成因子的调节。足细胞可产生血管生成因子，包括GEnCs生存所必需的血管内皮生长因子（VEGF）和血管生成素-1（Ang-1）；系膜细胞产生的血管生成素-2（Ang-2）也能到达GEnCs，调节其功能，并可能抵消Ang-1的促血管生成作用。而GEnCs自身也分泌许多血管活性因子，如内皮素-1(ET-1)、肾素-血管紧张素系统因子、一氧化氮合酶(NOS)等[8]。因此，上述各类血管生成因子的相互调节与平衡稳定对GECs的影响不容忽视。

3 EndoMT促进RF

3.1 EndoMT

EndoMT最初于胚胎发育期的心脏被发现，心内膜细胞通过EndoMT作用转变为间充质细胞，最终形成房室垫、室间隔和瓣膜的原始形态[9]。ECs发生EndoMT时，会失去其内皮标记物，如CD31、血管内皮钙粘蛋白（VEcadherin）和Von-Willebrand因子，并获得间充质标记物，如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（vimentin）和成纤维细胞特异蛋白（FSP-1），这种转变最初由Eisenberg等[10]描述。此外，在EndoMT发生的过程中，ECs的形态特征性表现为紧密连接的丧失和极性改变，纺锤体形成，细胞增殖和迁移能力增强，从而导致细胞骨架修饰和细胞连接重排，细胞形态也由鹅卵石样向梭形纤维化样转变[11]。在分子表达改变和形态学改变的持续积累下，ECs最终会丧失内皮表型而转化为MF，促进组织纤维化。在人机体内，EndoMT不仅参与了胚胎时期心脏的发育，还参与了多种疾病的过程。在不同病理因素的作用下，相关器官会发生纤维化，如心肌纤维化、肺纤维化、肝纤维化、角膜纤维化、肠纤维化、伤口愈合和RF等[12，13]。同时，EndoMT在动脉粥样硬化和肿瘤的进展中也发挥着重要作用[14，15]。

3.2 RF

ECM转换的病理失衡导致RF，此时MF的持续激活又导致ECM的过度沉积。纤维化时，ECM的病理性积聚增加了组织的硬度，从而进一步激活MF，导致激活的正反馈回路和肾组织硬度增加。肾组织的结构特征改变，会导致其顺应性降低，肾组织的功能受损[16]。RF的主要病理表现为肾小管萎缩和肾小球硬化，最终导致肾功能衰竭。因此，RF是多种因素相互促进、相互影响的复杂病理过程，主要涉及炎症反应、氧化应激反应、不同细胞因子分泌及信号级联反应、细胞凋亡、MF的增殖和活化，以及上皮细胞和GEnCs向MF转化等多种因素[17]。

3.3 EndoMT与RF的相关性

近来发现，某些病理条件如损伤、炎症以及衰老可以激活EndoMT并诱导RF[18]。在RF时，10%的MF来源于EndoMT，其余约90%来自原有增殖的纤维母细胞和骨髓细胞分化等[19]。Zeisberg等[20]为了明确EndoMT在RF中的作用，于2008年应用单侧输尿管梗阻模型（UUO：梗阻性肾病模型）、链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）模型以及系统缺乏胶原Ⅳα3链的小鼠模型(Col4A3Ko，Alport综合征小鼠模型)这三种慢性肾病小鼠模型，对其ECs的遗传谱系（Tie2-Cre，R26R-Stop-EYFP转基因小鼠ECs谱系）进行荧光追踪，对内皮和间质表型标记物进行双重标记，结果证实MF中确实存在EndoMT来源的GEnCs，这是对EndoMT可能导致RF发生的首次报告。

上述研究提示，EndoMT已经成为现今RF研究的一个重要方向，且此后又陆续有报道证实EndoMT确实参与了DN早期时的RF[21]。张诗翊等[22]研究显示，DN时的肾组织中Chemerin、ChemR23含量随病情进展而增加，α-SMA表达增多，CD31表达则减少，指出Chemerin/ChemR23参与了DN中的EndoMT过程。Liang等[23]首次报道，高级氧化蛋白产物（AOPPs）可通过内质网应激的诱导触发人GEnCs发生EndoMT，并随着DN患者血浆AOPPs水平的升高，肾功能也随之恶化。此外，还有研究证实，激活DKK3/Wnt通路能抑制GEnCs的生长，激活MF，促进EndoMT的发生，而Wnt途径抑制物sulindac-sulfide可下调DKK3的表达，阻止EndoMT的发生，进而抑制RF[24]。因此，靶向EndoMT可能具有治疗RF的潜力，但其上下游具体有哪些分子参与作用，还有待进一步研究证实。

4 介导EndoMT参与RF的因素

近年来的研究已证实，GEnCs可在多种生物介质及信号通路的协同作用下，暴露于极复杂的微环境中发生EndoMT，并进一步导致RF的发生和发展。其中的信号通路及生物介质包括转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路、Wnt信号通路、骨形态发生蛋白（BMP）、血管紧张素II（AngII）、成纤维细胞生长因子（FGF）、各类炎症相关的细胞因子，以及介导多个转录因子转录的非编码微小RNA（microRNA，miRNA）等。

4.1 细胞因子介导炎症条件下的EndoMT

一般来说，纤维化作为受损组织的一种修复机制，其特征是炎症介质的释放，从而触发以结缔组织替代正常细胞的纤维化过程。这种有益的修复过程在失控时可导致ECM的异常产生和积累，进而永久性瘢痕组织替代了正常细胞[25]。在炎症反应中，局部免疫细胞（主要是组织巨噬细胞）被激活，产生大量细胞因子，导致循环骨髓源性纤维细胞、上皮细胞和ECs等细胞被活化。当这些细胞突然从静息状态转向激活状态时，会高度表达α-SMA，并合成ECM成分，甚至转化为MF，即发生EndoMT[26]。其中比较重要的诱导内皮纤维化的炎症相关细胞因子包括TGF-β、促炎细胞因子白介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、转录因子NF-κB等，均已被证明能够激活GEnCs，并通过基于EndoMT的机制将其转化为MF，即GEnCs在逐渐失去内皮标志物（如CD-31等）的表达同时，开始表达纤维化标志物（如α-SMA等），ECM堆积，进而促进RF的发生[27]。因此，炎症条件下诱导的EndoMT过程与RF之间有着密切的关系。

4.1.1 TGF-β TGF-β是目前研究最为深入且主要的EndoMT诱导因子[28]，其超家族含有38个家族成员，如TGF-β、BMP、抑制素、激活素等，其中TGF-β在慢性肾脏病的进展中具有最重要的作用[29]。TGF-β有三种高度保守亚型，称为TGF-β1/2/3，这三种亚型在组织内呈现不同的分布模式和不同的生物学功能，但都通过不同的作用与EndoMT相关，且参与RF的发生[30]。Derada等[31]证实，脑内皮细胞(BECs)在炎症条件下，TGF-β可诱导BECs发生EndoMT，导致BECs功能障碍，血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）受损。此过程与GEnCs发生EndoMT，进而造成肾小球滤过屏障受损的机制极为相似。

TGF-β/Smad3是公认的导致RF的途径，Smad3可直接结合胶原的启动子区域，参与ECM的生成和降解。Chen等[32]研究证实了TGF-β可通过Smad3依赖性机制上调Smad7的合成，进而抑制NF-κB的激活和核移位，阻止GEnCs发生EndoMT。同时还发现，与野生型小鼠相比，Smad7缺陷型小鼠尿中的微量白蛋白显著上调，提示肾小球滤过屏障受损，RF加重。因此，Smad7可负调节炎症条件下TGF-β/Smad3介导的EndoMT，提示过表达Smad7可能对RF具有治疗潜力。

4.1.2 IL-1β 基于TGF-β可激活NF-κB的机制，Maleszewska等[33]证明了IL-1β和TGF-β2共刺激可导致NF-κB的核移位，协同诱导EndoMT的发生。IL-1β是一种促炎症细胞因子，主要由活化的巨噬细胞以非活性形式产生，然后被caspase1激活，再与IL-1β受体（IL1-R1、IL1-RAcP）结合，诱导白介素-1受体相关激酶（IRAK）活化，随后，NF-κB被活化并转移到细胞核，介导炎症条件下的EndoMT。其实早有研究证实IL-1β可对ECs的表型产生影响，这提示IL-1β极有可能介导了EndoMT的发生。Chaudhuri等[34]则证实了这一设想，他们证明了IL-1β本身就是EndoMT的诱导因子，且其作用强于TGF-β和TNF-α，而这三种细胞因子相联合，对EndoMT具有更强烈的诱导作用。张盟[35]所在的课题组也通过免疫印迹技术和ELISA法检测到UUO模型小鼠肾组织中IL-1β前体和IL-1β的表达均下降，提示IL-1β可通过直接和间接两种方式促进RF的形成。Mack[36]则通过细胞系分析确认了IL-1β诱导了GEnCs发生EndoMT。

4.1.3 其他炎症相关细胞因子 由上述可知，NF-κB是炎症条件下诱导GEnCs发生EndoMT的关键分子，而其他炎症相关细胞因子介导EndoMT的发生过程也与NF-κB的激活和核移位密切相关。例如，GEnCs中TNF-α通过诱导粘附分子（如血管细胞粘附分子1（VCAM-1）和细胞间粘附分子1（ICAM-1））的表达来促进活化[37]，进而与其受体TNF-R结合，诱导NF-κB向细胞核移位，诱发EndoMT。此外，TNF-α还能刺激IL-1β、CCL2和TGF-β1的释放，在肾小球炎症和RF中发挥显著作用[38]。

4.2 足细胞损伤介导的EndoMT

足细胞即肾小球上皮细胞，其在TGF-β的刺激下分泌的VEGF和Ang-1，具有保护GEnCs的作用[39]。Liang等[40]的体外实验研究发现，高剂量的血管紧张素受体拮抗剂(angiotensin receptor blocker，ARB）可以影响暴露于嘌呤霉素氨基核苷受损的足细胞，恢复足细胞产生VEGF和Ang-1的功能；进而又证实暴露于受损足细胞上清液的GEnCs无法生长，而暴露于ARB处理的受损足细胞上清液的GEnCs生长和分枝增强。

由于EndoMT与EMT（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的特征相似，都是失去各自的细胞表型及细胞附着力，转变为具有高度侵袭力、迁徙力、梭形细长的间充质细胞，因此，EndoMT通常被认为是EMT的一种特殊形式[41]。虽然与EMT相比，对EndoMT的了解还相对较少，但两者都与MF和器官纤维化有关[42]。且足细胞的EMT和GEnCs的EndoMT过程中激活产生的MF已证实是肾成纤维细胞的主要来源，均可引起RF[43]。然而，目前对足细胞发生EMT是否也会改变GEnCs的行为尚不清楚，需要进一步研究。

4.3 miRNA在EndoMT中的作用

miRNA是一组高度保守的非编码RNA分子序列，由近22个核苷酸组成，可以在转录水平上抑制和降解靶mRNA，导致基因和蛋白的表达受到抑制。高血糖、炎性细胞因子、衰老、高血压和缺氧的累积均可导致肾脏中miRNA表达谱的改变，并诱导EndoMT的发生，最终导致RF[44]。miRNA可在上述病理过程介导相关分子表达的改变，进而影响细胞的形态和功能，甚至发生细胞类型的转化。其中大多数miRNA是通过与TGF-β作用来介导EndoMT，进而促进RF的发生[11]。

4.3.1 miR-21 Kumarswamy等[45]研究发现，TGF-β可以通过沉默磷酸酶和张力素同源物（PTEN）基因或是激活Akt信号通路上调miR-21的表达，诱导EndoMT的发生，促进纤维化。miR-21还可通过靶向过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）来放大TGF-β1/Smad3信号通路，从而明显促进AngII诱导的RF[46]。与Smad3信号会使miR-21在肾脏中的表达大幅度上升不同，TGF-β/Smad信号通路的另一个下游效应子Smad2信号会反向调节Smad3，下调miR-21的表达，进而发挥对肾脏的保护作用[47]。此外，在高浓度葡萄糖干预下，GEnCs中miR-21的表达上调，PTEN/AKT/eNOS通路被激活，抑制MAPK/ET-1通路，从而影响GEnCs的分泌功能[48]。此外，有研究证实，miR-21的上调有效地激活了阻塞性肾脏病中的EndoMT的发生，加速了RF的进程[49]。

4.3.2 miR-29s Kanasaki等[50]通过分析DM小鼠肾脏的miRNA图谱发现，与对照组小鼠肾脏相比，DM小鼠肾脏中miR-29家族（miR-29s，包括miR29a/b/c）的表达被抑制。在进一步的实验中，他们证明了二肽基肽酶-4（DPP-4）为miR-29s的下游靶点，且发现被利格列汀（DPP-4抑制剂）作用下的人真皮微血管内皮细胞（HMVEC）中miR-29s的表达上调，EndoMT也有所改善。此外，Srivastava[51]课题组还证实了miR-29s可联合miR-let-7s，共同上调TGF-β2诱导的DPP-4水平，在DN时的RF中起着抗EndoMT的作用。

4.4.3 其他 miRNAmiR-155可以通过促进TGF-β1分泌来刺激EndoMT的发生[52]。Ghosh等[53]通过miRNA芯片技术发现，miR-125b可靶向P53增强TGF-β诱导的纤维化信号，促进EndoMT的发生。此外，miR-200a的过表达可阻断GEnCs的EndoMT，且miR-200a是通过TGF-β1/miR-200a/GRB2/EndoMT通路来调节RF的进程； miR-200a还可诱导人主动脉内皮细胞EndoMT的发生。因此，miR-200a可能成为未来各类因EndoMT导致的组织纤维化提供治疗新靶点[54]。

5 小结与展望

目前，尽管在动物和细胞实验中有大量的EndoMT促进RF发生的证据，但是在人类临床中的研究较少，而且对于EndoMT发生的细胞和分子机制有待于进一步研究。EndoMT可能成为是慢性肾脏病抗纤维化治疗靶点，根据EndoMT发生的机制，可采用炎症因子阻断剂如IL-1β和TNF-α的抑制剂、TGF-β信号通路阻断剂、足细胞EMT抑制剂等延缓RF的进展。同时，随着基因水平研究的不断深入，未来的研究工作还应该着重研究miRNA介导EndoMT的作用机制，这会给人类RF疾病的治疗提供一种全新的靶点和方法。