人多能干细胞分化为肝细胞的新技术及其应用

马鸿倩 鄢和新

当肝脏受到致病因素(代谢、酒精、病毒、遗传性、癌症、免疫、毒性或药物相关)损害时，导致肝功能不全，发生不可修复的器官损伤，甚至危及生命。原位肝移植(OLT) 是治疗肝衰竭唯一有效的方法，但供肝数量有限限制了肝移植的应用。此外，移植后的终身免疫抑制治疗会增加感染、恶性肿瘤和其他不良反应发生的风险。

人工肝系统可以作为OLT的一种有效过渡替代治疗，然而，该系统无法实现肝脏代谢功能以及患者血浆中重要的生物活性物质被吸附清除这两个缺陷限制了它的长期使用。目前正在开发的生物人工肝(BALs)是指在生物反应器中加入肝细胞来模拟人体正常肝脏，从而代替受损肝脏发挥解毒、合成和生物转化等功能的一种体外肝功能支持系统，在肝病患者的临床治疗中有着广阔的应用前景。

肝细胞移植也可以替代OLT用于肝脏疾病的治疗，特别是当仅有肝功能缺陷而器官的结构未受到影响时(例如某些单基因遗传病)，或者作为肝移植等待期的桥梁。然而肝病的细胞疗法目前也存在许多问题亟待解决。

一、hPSC可为肝细胞应用提供新的细胞来源

PHHs是肝细胞治疗的金标准，但其供应不足、成本高、增殖能力低、代谢活性丧失快，限制了它们在体外的应用。使用人胚胎干细胞(hESCs)作为细胞治疗的来源会受到伦理问题的限制。2007年，山中伸弥[1]将人类成体细胞重编程得到了一种类似于hESCs的细胞，即人诱导多能干细胞(hiPSCs)。之后，更多的研究发现，可以使用不同的重编程技术和体细胞类型来获得hiPSCs。hiPSCs的分化方法为肝脏疾病的研究和治疗提供了无限的肝细胞来源[2]。尽管多能干细胞来源的肝样细胞(PSC-HLCs)表型更接近于胎儿肝细胞，而不是成人肝细胞[3]，但它们已被有效地用于慢性肝病或急性肝衰竭动物模型的移植治疗，表明这些细胞可以在体内进一步成熟[4]。这说明分化细胞缺乏成熟度可能不是它们在移植中使用的障碍。然而药物筛选、毒理学研究以及BAL的应用都依赖于肝细胞的功能，因此需要完全成熟的肝细胞。目前已经开发了新的方法如向培养基中添加小分子、建立共培养模型和三维(3D)培养模型等来提高培养系统中PSC-HLCs的功能。

二、在2D培养系统中促进hPSC向肝细胞分化的研究

(一)小分子化合物 hPSCs的体外培养往往需要加入生长因子或细胞因子实现肝细胞的分化，研究发现一些小分子例如CHIR99021(激活Wnt/β-catenin途径)和LY294002(PI3K抑制剂)的加入也可以提高分化效率。在内胚层分化过程中，添加维甲酸、染色质调节剂DMSO或Wnt/β-catenin途径的Wnt反应抑制剂IWR-1也能促进hPSCs向肝系的分化。化合物E(抑制Noch通路)和SB431542(抑制TGFβ通路)可以阻止肝祖细胞向胆管细胞分化，从而有利于肝细胞的分化。与生长因子相比，这些小分子不容易发生批次变化，在药品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)中更容易被接受。

(二)细胞外基质 肝细胞具有复杂的极化功能和极强的黏附特性，需要多种因素相互作用才能在体外维持其生理特性和功能，例如肝细胞转运功能依赖于肝细胞的极化和细胞与基质之间的相互作用。因此，开发了人工构造(如纳米纤维、薄膜或水凝胶)来模仿细胞微环境，以增强肝细胞的黏附、迁移和增殖能力。这些支架通常由胶原、壳聚糖、明胶、海藻酸盐和琼脂糖等天然聚合物或聚ε-己内酯和聚L-乳酸等合成物制成。

将PHH培养在两层I型胶原或Matrigel之间，形成的结构与体内观察到的细胞与细胞、以及细胞与基质之间的结构相似。目前已将该模型应用于hESCs，使其能够更好地分化为最终的内胚层，增强HLC的极化功能[5]。

(三)hPSC来源肝细胞的共培养 单独在体外培养PHHs时其功能会迅速退化，但它们与间充质干细胞或肝窦内皮细胞共培养时其白蛋白分泌功能和细胞色素活性显著提高。因此，在PSCs分化期间，开发了一系列共培养模型如PSCs与成纤维细胞、基质细胞和肝星状细胞的共培养。另外还有研究表明，当HLCs与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共同培养时，改善HLC特性的主要是共培养培养基而不是HUVECs[6]。

三、hPSC向肝细胞分化的三维培养系统

(一)三维球体 球状体是由PHHs、肝源性细胞系或iPSC-HLCs自聚集产生的，是一种可有或没有非实质细胞支持的三维肝脏模型。对PHHs组成的球状体模型进行测试，确定了防止球体坏死的最大尺寸以及允许培养的最佳细胞密度等参数。在3D球体模型中培养PHHs以及hiPSC-HLCs可以延长细胞的体外培养时间，并保持特异性标志物的表达和细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)的活性[7]。

(二)类器官 类器官是一类由干细胞在体外培养时形成的，能够进行自我组装的3D微观结构，可以模仿器官在体内的某些功能[8]。将hiPSCs与人类脐静脉内皮细胞和人类间充质干细胞混合培养会形成一个微小的血管化3D结构，即肝芽(Liver buds)[9]。然而该类器官缺乏胆管结构，可能会阻碍这种模型的长期使用。目前开发了肝细胞与肝星状细胞或胆管细胞共培养的系统来提高蛋白质产量。

(三)生物打印肝脏 生物打印是使用计算机控制，以细胞或细胞聚集体为原料，逐层或逐点地构建组织和器官的一种打印技术[10]。与2D培养系统相比，将hiPSC-HLCs在明胶中进行生物打印，可提高白蛋白分泌、尿素产生能力以及多种CYP的表达水平[11]。

(四)微芯片 微芯片添加了一个相当于血液流动的装置即微流控系统，提供氧气和营养物质并排出废物，从而可以更好地模拟体内的细胞环境。有报道称在芯片上创造从常氧到严重缺氧的氧浓度梯度，可以模拟肝脏中产生的生理氧梯度，从而用于研究体内肝脏分区的形成。与静态系统相比，hiPSC-HLCs的3D流体芯片模型具有显著的肝脏特异性功能，包括白蛋白和尿素的产生能力以及代谢能力[12]。

然而，生物打印肝脏和微芯片都是由人为设计和制造而成，因此它们的使用只能限制在我们对器官的认知范围内。

(五)封装系统 封装是指将细胞包裹在由水凝胶制成的半透球中，其中水凝胶可以根据需要进行化学修饰以调整其孔隙大小。在该系统中，可以通过水凝珠进行营养物质、氧气、二氧化碳的交换和信号传递，并且允许生长因子、代谢物和废物的扩散以及防止抗体的入侵。将hPSCs球体或类器官封装在海藻酸多聚-L-赖氨酸水凝珠中可以保持细胞活力，并允许其向肝细胞的分化。在小鼠中成功植入了被包裹的hiPSC-HLCs聚合体，其血液中人白蛋白的分泌水平与PHHs相似[13]。

四、hPSC向肝细胞分化的应用研究进展

(一)疾病建模 从患者活检组织中获得的hiPSCs分化为一种特定的细胞类型，可以进行遗传病的体外建模，例如hiPSC-HLCs可用于胆固醇代谢调节的研究。然而这些模型的生存能力在很大程度上依赖于分化细胞的特性和功能，就肝细胞而言，模型的建立可能会受到细胞成熟不完全的限制。

使用人体类器官模拟遗传病包括α-1抗胰蛋白酶缺乏症和囊性纤维化[14]，然而，在大多数情况下，人们只通过研究相关蛋白的表达来研究特定突变的影响，受突变影响的下游网络往往缺乏文献记载。除单基因疾病外，iPSC-HLCs类器官与游离脂肪酸联合处理可模拟非酒精性脂肪性肝病的脂质堆积和纤维化过程。

(二)毒理学研究 HLCs可以保留一些供体细胞的表型，对更罕见的表型进行可重复建模，它还兼具PHH的代谢能力以及癌细胞系的增殖能力和重复性，使用HLCs作为肝脏模型进行毒理学研究具有良好的前景。但在体内观察到的毒性反应是由不同细胞类型之间复杂的相互作用介导的，使用单一肝细胞培养物模拟药物诱导的肝毒性作用有限，将HLCs与支持细胞共培养可以在一定程度上延长其肝功能的维持。

(三)药物筛选 药物筛选是用来研发可以选择性地与基因和基因产物相互作用的药物，或者可以干扰特定分子机制的药物，以便将这些药物用于人类临床试验。药代动力学和药效动力学知识的运用在药物筛选中至关重要。使用2D模型筛选的过程中，塑料吸附等现象可能会影响剂量和药物效应的关系。三维球体、类器官和器官芯片更适合用于研究药物的药代动力学曲线。

(四)生物人工肝 BALs的原理是将患者血浆通过体外循环与生物反应器中的人肝细胞进行物质交换，短时间替代肝脏工作，并促进受损肝脏再生修复，可帮助部分肝衰竭患者恢复肝功能。BALs需要大量的肝细胞来维持患者的血液透析和肝脏功能，PSC-HLCs可以作为其中的生物成分，但它们的长期生存能力低，以及生产成本高阻碍了其快速应用。

(五)组织工程的临床应用 由于健康供体组织的数量有限，以及组织排斥反应存在风险，再生医学的应用受到了一定程度的限制，使用同基因或人类白细胞抗原(HLA)相容的hiPSC-HLCs可以克服这一障碍。一种方法是将hiPSCs接种到脱细胞的人肝细胞外基质支架上进行分化，与标准分化相比，使用肝脏脱细胞支架会导致肝功能标志物上调，一些转录因子和核因子的表达水平与成人PHH相当[15]。另一种方法是使用PSC衍生的类器官[16]。对于类器官移植而言，如何在冷冻保存后，仍然能制备可扩增的、重复性高且稳定的类器官模型是最后的挑战。最近的一项研究报道称，hESC来源的类器官可以扩增20代，并且能稳定地保持双潜能前体细胞的表型特征[17]。在小鼠体内移植后，它们可以分化为有功能的肝细胞或胆管上皮细胞，并展现出显著的再殖能力。

此外，研究者把hiPSCs来源的细胞组成的肝芽异位移植到免疫缺陷的小鼠身上，发现肝芽可以快速地与小鼠的血管连接并且在10 d之后开始正常运作，移植到小鼠体内的肝芽在代谢方面与成人肝脏具有相似性。将肝芽移植到ALF小鼠模型中发现，与对照组相比，ALF小鼠存活率提高，表明移植到体内的肝芽具有肝脏自我修复能力，可作为桥梁发挥治疗作用[9]。

五、hPSC来源的类器官在临床治疗应用中的限制

(一)实用操作问题 分化细胞的自体移植不仅需要将患者的细胞重编程为hiPSCs，还需要在患者患有单基因疾病的情况下，校正其基因以及促进其向肝细胞分化。这些过程可能需要3～4个月的时间，因此这种方法只适用于中度或较轻的病例。此外，还应该考虑到hiPSC-HLCs高昂的生产成本。随着人类白细胞抗原(HLA)特征化冻存细胞库以及即用型细胞治疗产品的发展，同种异体移植的优势逐渐显现出来，因此，应开发有效的低温保存方法来维持冷冻前肝细胞功能。目前很难大规模生产类器官，因为它需要PSCs的大规模培养，将类器官生产标准化和自动化(至少部分自动化)十分必要。

最后还需要确定肝细胞移植的途径。门静脉内注射可以将大量细胞输送到肝窦，在无肝纤维化的患者中耐受性良好，然而这一方法可能导致门静脉压力升高，增加门静脉血栓形成的风险。还有一种方法是使用海藻酸盐水凝珠包裹肝细胞来进行移植，可以保护肝细胞不受患者免疫反应的排斥，这种方法在临床前研究中产生了很好的疗效。

(二)PSC-HLCs的安全问题 已建立GMP级别PSC株，可分化为肝细胞，并且具有高度可复制的表型和功能。对于最终产品质量的控制，不仅要考虑其功能，还要保证其安全性。hPSC-HLCs具有潜在的遗传不稳定性,虽然不是所有的突变均会产生不良影响或形成肿瘤，但使用hPSC-HLCs必须保证PSCs基因组完整性。目前，细胞在分化为hiPSC-HLCs过程中基因组完整性的保存缺乏文献记载，而且尚未建立分化方案和其遗传完整性之间的联系，这方面还需要进一步研究。此外还需考虑到最终治疗产品中残留的hPSCs在小鼠体内形成肿瘤的可能性。

许多研究小组对hPSC-HLCs的免疫原性进行了研究，一部分表明免疫系统对它们有很好的耐受性[18],另一部分根据所使用的细胞系不同而显示出不同的免疫反应[19]。

(三)hPSC-HLCs在临床应用中的伦理问题 由于hPSC-HLCs的来源和对hESCs的潜在应用，该技术在细胞治疗中的使用涉及到伦理问题。细胞治疗、基因治疗和组织工程都需要随着生物医学或再生医学领域技术的进步以及PSC研究等新领域的出现而迅速修订相关法规。

综上，由于PHHs来源有限以及在体外肝功能会迅速丧失，现已建立了一系列培养系统促进hPSC向肝细胞分化，并且在体外长期维持肝细胞功能。该系统可以作为药物筛选和毒性分析的一种理想模型。目前已将临床级别的PSC-HLCs用于临床治疗研究，但该技术的发展还需细胞生物学、临床护理、生物工程和生物相容性材料科学等多学科跨学科的合作，才能在未来实现更好的应用前景。