恶性胸膜间皮瘤中间皮素表达的临床病理相关性及其预后意义

2021-03-26李素芬王唯斯自加吉

井冈山大学学报(自然科学版) 2021年2期

李彬，李素芬，王唯斯，杨娜，自加吉，熊伟,2

李彬1，李素芬1，王唯斯1，杨娜1，自加吉3，*熊伟1,2

（1. 大理大学基础医学院生物化学与分子生物学教研室，云南，大理 671000；2．云南省高校临床生物化学检验重点实验室，云南，大理 671000；3. 大理大学基础医学院病理学教研室，云南，大理 671000）

通过探讨间皮素（MSLN）与恶性胸膜间皮瘤临床病理之间的相关性及其预后意义。采用R 3.6.3对美国公共癌症基因数据库（TCGA）进行数据挖掘和分析，利用Oncomine数据库对非癌组织与癌组织中MSLN的表达量进行比较分析，采用基因表达谱动态分析（GEPIA）构建Kaplan-Meier生存模型探究MSLN表达量对恶性胸膜间皮瘤患者预后的影响，使用cBioportal进行MSLN基因相关性可视化分析。结果表明，MSLN在正常组织中低表达，恶性胸膜间皮瘤组织中高表达；MSLN的表达水平与恶性胸膜间皮瘤的肿瘤类型及组织学诊断类型相关；在MPM患者中，MSLN高表达的患者总生存率显著高于MSLN低表达的患者。因此，间皮素有望作为恶性胸膜间皮瘤诊断或治疗的潜在新靶点。

恶性胸膜间皮瘤；间皮素；数据挖掘；预后意义

恶性间皮瘤（Malignant mesothelioma, MM）是一种较为罕见的、具有高度侵袭性的浆膜表面肿瘤，多发于胸膜间皮[1]。胸膜间皮瘤是由环境、生物和遗传因素引起的肿瘤。流行病学和实验数据都清楚地证明了石棉暴露与恶性间皮瘤发生之间的关系[1]。恶性胸膜间皮瘤（Malignant pleural mesothelioma, MPM）预后较差，5年内患者的生存率仅为5％左右[2]。胸膜腔积液是恶性胸膜间皮瘤的主要发病方式，并且其误诊率较高，大多被误诊为肺结核，恶性胸膜间皮瘤的淋巴结转移规律不同于一般肺癌[3]。目前，MPM的诊断标准主要为胸腔镜活检，缺乏较为便捷以及灵敏度高的血清学标志物检测。因此，发掘新的肿瘤标志物能有效提升早期MPM的检出率，从而为患者提供及时的治疗。

间皮素（mesothelin，MSLN）是在分离单克隆抗体(Mab)K1时发现的一种分子质量为40 kDa的细胞膜糖蛋白[4]，其在胸腹腔及心包间皮细胞中呈低表达，但在肺癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤中高表达[5]，因此，间皮素可以作为诊断或治疗此类特异性较高的肿瘤的血清学标志物[6-7]。大量的研究发现，MPM属于特异性较强的恶性肿瘤，单一的生物学标志物无法准确进行诊断[8]。MSLN表达与MPM的相关性及作用机制尚不明确，本研究利用美国公共癌症基因数据库（The Cancer Genome Atlas, TCGA）和Oncomine基因芯片数据库进行数据挖掘，并分析讨论MSLN与MPM之间的关联。

1 材料与方法

1.1 利用Oncomine数据库中筛选目的基因在肿瘤与非瘤组织中的相关性

Oncomine 数据库(http://www.oncomine.org) 是目前最大的肿瘤基因芯片数据库和整合数据获取平台，可用于进行基因表达差异分析，离群值分析、组织类型分类等数据分析处理功能，本研究中，在Oncomine数据库中设置搜索条件为①“Gene:”；②“Analysis Type: Cancer vs. Normal Analysis”；③“Cancer Type: Othere Cancer- Mesothelioma-Pleural Malignant Mesothelioma ”；④“Simple Type: Clinical Specimen”。

1.2 在TCGA数据库中收集恶性胸膜间皮瘤数据

使用R 3.6.3软件，利用Epicalc函数包从美国公共癌症基因数据库TCGA（http://tcga-adtaa. nci.nih.gov/tcga/）下载并预处理恶性胸膜间皮瘤的数据集，进行表达量的分析，同时下载临床病理资料数据，进行临床病理参数相关性分析。

1.3 TCGA乳腺癌数据集筛选和临床病理学参数相关性分析

通过R 3.6.3下载得到数据集MSLN-meso_ tcga，其中包含87例关于胸膜间皮瘤的样本病例。通过对应临床数据资料进行对比筛选分析，剔除缺失数据及无效数据，仅保留TCGA数据库中完整有效的数据集82例。根据测序结果分析，恶性胸膜间皮瘤组织样本中MSLN的表达量为11.26~108975.7，中位数为14905.26，以该表达量中位数为界限，样本MSLN表达量高于中位数，则定义为MSLN高表达（high）；反之，则定义为MSLN低表达（low），根据这个定义，间皮瘤组织中MSLN高表达41例，低表达41例。

1.4 间皮瘤分子病理分型

TCGA数据集根据间皮瘤的病理学分型将其分为3类分子分型。（1）肉瘤样型Sarcomatoid Type；（2）上皮样型Epithelioid Type；（3）双向混合型Biphasic Type。

1.5 MSLN表达水平与恶性胸膜间皮瘤患者的预后相关性

为探究MSLN的表达量与恶性胸膜间皮瘤之间的预后关系，本研究采用基因表达谱动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn)数据库对数据构建Kaplan-Meier模型，从而探究MSLN与MPM之间的预后关系。

1.6 MSLN的相关性研究

cBioportal（http://www.cbioportal.org/）是基于公共数据库研究分析癌症基因数据的可视化工具，通过自定义数据从而探求基因改变和临床之间的联系，并使其可视化。通过选择间皮瘤和MSLN，可得出MSLN于其他基因的相关性可视化分析图。

1.7 统计学分析

建立间皮瘤患者的临床病理数据集，将患者年龄、性别、AJCC 病理分期、T分期、M分期、N分期、癌症类型、组织学诊断和MSLN表达量进行量化赋值，结果见表1。采用R 3.6.3进行统计学分析及绘图，使用Shapiro-Wilk检测癌组织中MSLN 表达水平两组数据正态分布情况，结果显示MSLN表达水平不符合正态分布。因此，间皮瘤组织的 MSLN表达水平的比较采用 Mann-Whitney U 非参数检验，临床病理参数相关性分析，组间比较采用χ2检验及Fisher 精确概率法，生存分析采用 Kaplan-Meier模型。

表1 恶性胸膜间皮瘤患者预后影响因素及其赋值关系

Table 1 Prognostic factors influencing patients with malignant pleural mesothelioma and their relationship

影响因素赋值说明年龄≤60岁=1，＞60岁=2 性别男=1，女=2 T分期T1+T2=1，T3+T4=2，TX=3 N分期N0=0，N1=1，N2=2，N3=3 ，NX=4 M分期M0=0，M1=1，MX=2 AJCC 病理分期I+Ⅱ期=1，Ⅲ+Ⅳ期=2 癌症类型肉瘤样型=1，上皮样型=2，双向混合型=3 组织学诊断肉瘤样型=1，上皮样型=2，双向混合型=3 MSLN表达量生存时间生存状态低表达=1，高表达=2实际生存时间（月）存活=0，死亡=1

2 结果

2.1 MSLN的表达量在正常细胞与MPM中的差异

通过Oncomine数据库数据筛选分析，所得结果显示正常组织及有关恶性胸膜间皮瘤的共54个样本中，结果显示，与正常的肺组织和正常胸膜组织相比，恶性胸膜间皮瘤中MSLN的表达量与中的表达升高，组间有显著差异（Fold change=15.497,=2.37×10-5），如图1所示。

1：正常肺组织 2：正常胸膜组织 3：恶性胸膜间皮瘤

2.2 恶性胸膜间皮瘤组织中MSLN的表达及其临床病理相关性

在TCGA 数据库下载并整理得到临床病理参数完整82例恶性胸膜间皮瘤病例资料，其中女性 16例，男性66例，年龄28~81岁，中位年龄64岁。对该数据集中乳腺癌患者预后的各影响因素进行赋值，通过统计学分析，其中恶性胸膜间皮瘤组织中MSLN 低表达41 例，高表达41 例。MSLN表达量与MPM患者的癌症类型(＜0.001)以及组织学诊断类型(＜0.001)存在显著相关性，而与患者的年龄、性别、T分期、N分期、M分期、AJCC 病理分期均无显著相关性(均> 0.05)，详见表2。

表2 MSLN表达量与恶性胸膜间皮瘤临床病理特征的相关性

Table 2 Correlation between MSLN expression and clinicopathological features of malignant pleural mesothelioma

病理因素例数MSLN 表达P值χ2 低表达高表达年龄（岁） 0.6490.210 ≤ 60311417 ＞60612724 性别 1.0000.000 女1688 男 66 33 33 T 分期（期） 0.502- T1+T2371423 T3+T443 26 17 TX211 N 分期（期） 0.148- N0412219 N11055 N2 24 816 N3 3 3 0 NX 4 3 1 M 分期（期） 0.316- M0532924 M1 2 0 2 MX 27 12 15 AJCC 病理分期（期） 0.7290.834 I+II251114 III+Ⅳ57 30 27 肿瘤类型 < 0.001- 上皮型220 肉瘤型57 21 36 混合双向型23 18 5 组织学诊断 < 0.001- 上皮型220 肉瘤型57 21 36 混合双向型23 18 5

2.3 MSLN表达水平与恶性胸膜间皮瘤患者的预后相关性

使用GEPIA数据库构建Kaplan-Meier模型，结果表明，MSLN的表达对恶性胸膜间皮瘤患者的总生存率（OS）预后有影响（< 0.05），当MSLN在肿瘤组织中低表达时，患者预后差；反之，MSLN高表达的患者预后较好。MSLN的表达水平对MPM患者的无疾病进展生存率（DFS）无显著影响（> 0.05），如图2所示。

A: overall survival: 总体生存率

B: disease free survival：无病生存率

图2 MSLN表达量与总生存率的关系

Fig. 2 Relationship between MSLN expression and overall survival rate

2.4 胸膜间皮瘤中MSLN基因与其他基因表达的相关性

通过可视化分析，得出与MSLN基因表达相关性最高的9个基因，分别为ANXA8、BICDL1、CLDN15、COBL、FBXO2、PDZK1IP1、RSPO1、UPK1B、VSIR。经分析，以上9种基因均与MSLN基因的表达有显著性关联（< 0.05），且均为正相关，即MSLN基因的表达量越高，则相关基因的表达量也越高，结果如图3所示。

3 讨论

恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种罕见的胸腔恶性肿瘤，起源于胸膜腔的间皮细胞[9]。MPM总体预后较差，上皮型MPM预后相对较好，肉瘤型预后最差，未经治疗的MPM中位生存期为12个月，6个月、1年和5年的生存率分别为55%、33%和5%[10]。本研究通过数据挖掘分析了间皮素（MSLN）的表达与恶性胸膜间皮瘤发生之间的相关性，发现MSLN在正常肺组织或胸膜组织中均呈现低表达，在MPM组织中呈现高表达，并且MSLN的表达量与肿瘤的病理类型以及组织学诊断类型有显著相关性。然而，本研究的预后生存分析结果显示，MSLN高表达的MPM患者总生存率明显高于MSLN低表达的患者。吴海净等利用病理诊断为胸膜间皮瘤及随访资料齐全的38例病例，研究间皮素的表达对恶性胸膜间皮瘤预后的影响，结果表明，间皮素高表达的患者的总生存期低于间皮素低表达的患者[11]。我们分析产生这种差异的原因可能有以下几点：（1）本研究中使用的TCGA间皮瘤数据集中提供的是间皮素基因mRNA表达水平，而吴海静等的研究采用免疫组化化学染色的方法，检测的是间皮瘤组织中间皮素蛋白的表达水平。间皮素mRNA表达水平和蛋白质表达水平对患者预后的影响可能存在一定的差异。（2）两项研究中高表达和低表达分组的标准和依据不一样。本研究使用的数据是基于RNA二代测序结果，以间皮素mRNA表达量的三等分数值为截断值，进行高表达、中表达和低表达分组。吴海静等的研究则是基于免疫组织化学评分结果划分高表达和低表达组，导致患者预后分析的结果与本研究存在差异。（3）研究对象的样本数的不同导致出现预后分析结果差异。本研究分析了TCGA数据库中82例患者的间皮素mRNA二代测序数据，而吴海静等的研究结果是基于38例间皮瘤患者间皮素蛋白的表达水平来进行预后分析。因此，本研究结果提示，单一的间皮素检测可能并不利于对患者预后进行评估和预测。间皮素与其他肿瘤生物学标记物的联合检测，可能会相互弥补，提高预后判断价值，减低患者的死亡率。

目前，血清可溶性间皮素相关肽（SMRP）已被提议作为MPM的诊断或预后生物标志物[12]，而MSLN基因变异可以影响血清中SMRP的水平，并与MPM患者生存期缩短有关[13]。研究表明，通过沉默纤维蛋白3（Fibulin-3）基因，可以有效改变MPM细胞的生长[14]。后续研究中，我们将通过构建MSLN基因沉默的MPM细胞模型，探究其对于MPM细胞增殖和生长的影响，从而对未来临床MPM的治疗提供实验依据。同时，由于胸膜间皮瘤细胞的免疫应答依赖于树突状细胞（dendritic cell, DC）为主的抗原呈递给细胞从而识别[15]，因此，研发出抗癌疫苗，通过免疫应答对胸膜间皮瘤进行相关治疗。综上所述，MSLN的高表达于恶性胸膜间皮瘤的发生有一定的关联，MSLN有希望作为MPM诊断或治疗的潜在靶点。

由于恶性胸膜间皮瘤的发病机制复杂，病例较为罕见，临床收集病例较为困难，本研究使用美国公共癌症基因数据库（TCGA）中的恶性胸膜间皮瘤病例数据，临床数据样本量更大，所得结果可信度较高。本研究表明，在未来MPM的诊断治疗中，通过结合遗传因素和血清因素等多种检测方式可为MPM患者提供更好的诊断或预后生物标志物，为恶性胸膜间皮瘤的临床诊疗奠定了理论基础。

[1] Munson P, Lam YW, Dragon, J, et al. Exosomes from asbestos-exposed cells modulate gene expression in mesothelial cells[J]. FASEB J, 2018, 32 (8): 4328-4342.

[2] Yamashita T, Nagano K, Kanasaki S, et al. Annexin A4 is a possible biomarker for cisplatin susceptibility of malignant mesothelioma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 421 (1): 140-4.

[3] 常浩,余宗艳,王启明,等. 120例恶性胸膜间皮瘤的临床特征及诊断分析[J]. 肿瘤, 2020, 40(3): 199-205.

[4] Chang K, Pastan I. Molecular cloning of mesothelin, a differentiation antigen present on mesothelium, mesotheliomas, and ovarian cancers[J]. Proc Natl Acad Sci, 1996, 93 (1): 136-40.

[5] 姜静,辛伟,李慎军,等. 靶向间皮素的肿瘤治疗生物技术药物研究进展[J]. 药学进展. 2019, 43(12): 922-934.

[6] Ohar J A, Cheung M, Talarchek J, et al. Germline BAP1 mutational landscape of asbestos-exposed malignant mesothelioma patients with family history of cancer[J]. Cancer Res, 2016,76(2): 206-215.

[7] Baumann F, Flores E, Napolitano A, et al. Mesothelioma patients with germline BAP1 mutations have 7- fold improved long-term survival[J]. Carcinogenesis, 2015, 36(1): 76-81.

[8] 朱桂璐. 生物学标志物诊断恶性胸膜间皮瘤的研究进展[J]. 临床与实验病理学杂志, 2019, 35(07): 820-822.

[9] 漆骏,陆荣安,李刚,等. 2007—2012年云南省大姚县胸膜间皮瘤死亡分析[J]. 职业与健康, 2014,30(17): 2416-2418.

[10] 邢荣格,张晓玲,周玮玮,等. 胸膜上皮型恶性间皮瘤临床病理特征及相关抗体研究[J]. 中国煤炭工业医学杂志, 2016, 19(1): 64-68.

[11] 吴海净.硕士.间皮素的表达对恶性胸膜间皮瘤预后的影响[D].济南:山东大学.2017.

[12] 余珉,陈钧强,张幸. 可溶性间皮素相关蛋白在石棉接触人群健康监护中的应用探讨[J]. 中华劳动卫生职业病杂志, 2016, 34(1): 75-78.

[13] Goricar K, Kovac V, Dodic-Fikfak M, et al. Evaluation of soluble mesothelin-related peptides and MSLN genetic variability in asbestos-related diseases[J]. Radiol Oncol, 2020, 54 (1): 86-95.

[14] 莫世贤,邓勇军,刘焕鹏,等. Fibulin-3表达对恶性胸膜间皮瘤细胞的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2019, 35(3): 448-453.

[15] 程康,呼群. 恶性胸膜间皮瘤免疫治疗进展[J]. 医学综述, 2018, 24(12): 2367-2372.

CLINICOPATHOLOGIC CORRELATION OF MESOTHELIN EXPRESSION IN MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA AND ITS PROGNOSTIC SIGNIFICANCE

LI Bin1, LI Su-fen1, WANG Wei-si1, YANG Na1, ZI Jia-ji2,*XIONG Wei1,2

(1. Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Basic Medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 2. Laboratory of Clinical Biochemistry Test of Yunnan Province, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China; 3．Department of Pathology, College of Basic medical Sciences, Dali University, Dali, Yunnan 671000, China)

This study will further discuss the relationship between MSLN and malignant pleural mesothelioma. In the present study, R 3.6.3 was used for data mining and analysis of the US public cancer gene database (TCGA), and the Oncomine database was used to compare and analyze the expression of MSLN in non-cancer and cancer tissues, and dynamic analysis of gene expression profiling (GEPIA) was used to build a Kaplan-Meier survival model for exploring the effect of MSLN expression on the prognosis of patients with malignant pleural mesothelioma, and the cBioportal was used for visual analysis of MSLN gene correlation. The expression of MSLN was low in normal tissues, but high in cancer tissues; the expression of MSLN was correlated with the tumor type of malignant pleural mesothelioma; among MPM patients, the overall survival rate of patients with high MSLN expression was significantly higher than that with low MSLN expression. In conclusion, mesothelin can be used as a new target for the diagnosis or treatment of malignant pleural mesothelioma, which lays a theoretical foundation for the future attack of related cancers.

malignant pleural mesothelioma; mesothelin; data mining; prognosis

R734.3

10.3969/j.issn.1674-8085.2021.02.009

1674-8085(2021)02-0050-06

2020-12-16；

2021-01-18

国家自然科学基金项目（31601155）

李彬(1996-)，男，云南大理人，硕士生，主要从事细胞分子生物学研究(E-mail:812276241@qq.com);

李素芬(1993-)，女，山东济宁人，硕士生，主要从事肿瘤分子生物学研究(E-mail:1446198172@qq.com);

王唯斯(1991-)，男，内蒙古呼伦贝尔人，硕士生，主要从事肿瘤生物信息学研究(E-mail:313731142@qq.com);

杨娜(1994-)，女，云南楚雄人，硕士生，主要从事肿瘤分子生物学研究(E-mail: 1432656992@qq.com);

自加吉(1980-)，男，云南大理人，讲师，硕士，主要从事分子病理学研究(E-mail:dldxjcyxyzjj@163.com);