红参中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量的测定

刘春霖，谢强胜，李启艳，高天阳，刘慧香，蒋慧

(山东省食品药品检验研究院,山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东 济南 250101)

红参为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey. )的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎。具有大补元气，复脉固脱，益气摄血的功能[1]。现代科学研究表明，红参可以提高人体免疫力、抗疲劳、抗衰老、抑制肿瘤、调节神经、心血管及人体内分泌系统等功效[2-7]。红参中含有的成分很多，人参皂苷类成分是其主要药理活性成分。红参是将鲜参或生晒参经高温蒸制干燥而得，鲜参中的皂苷类成分会发生糖苷键和酯键的断裂，生成某些特有皂苷[8]，主要体现在较大极性人参皂苷的脱糖基转化以及人参皂苷C-17位侧链的变化[9-11]。红参中特有的皂苷组分所含糖链更少，极性更低，更有利于人体肠道吸收。因此，人参皂苷是衡量红参质量优劣的重要指标。

人参皂苷的主要分析方法有高效液相色谱法(HPLC)、比色法(UV)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等[12]。其中高效液相色谱法和比色法为常用的人参皂苷测定方法，高效液相色谱法适合单体人参皂苷含量的测定，比色法适合人参总皂苷含量的测定[13]。因此，本文以皂苷类成分为测定指标，采用紫外可见分光光度法、高效液相色谱法，分别对红参中总皂苷及人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Mettler Toledo Ms十万分之一电子天平(德国梅特勒公司)；TU-1901紫外分光光度计(北京普析通用公司)；岛津LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(上海树立仪器仪表有限公司)。

1.2 试剂试药 甲醇、乙腈，色谱纯；磷酸、正丁醇、三氯甲烷、乙醇、高氯酸、冰乙酸，分析纯；水为超纯水；5%香草醛溶液：称取5 g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100 mL。

对照品：人参皂苷Re(含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号110754-201626，纯度97.4%)；人参皂苷Rg1(含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号：110703-201832，纯度92.4%)；人参皂苷Rb1(含量测定用，中国食品药品检定研究院，批号：110704-201424，纯度93.7%)。

红参药材：吉林省20批，辽宁省4批，黑龙江省2批，均经山东中医药大学田景振教授鉴定为五加科植物人参(PanaxginsengC.A.Mey.)的栽培品经蒸制后的干燥根和根茎。

2 方法与结果

2.1 红参中总皂苷含量的测定方法 精密称取红参样品粉末适量(过四号筛，称样量根据总皂苷含量定)，置100 mL容量瓶中，加少量水，超声15 min，再用水定容至100 mL，摇匀，放置，吸取上清液1.0 mL进行柱层析。取层析柱，内装3 cm D-101大孔吸附树脂，上加1 cm中性氧化铝。先用25 mL 70%乙醇洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，精确加入1.0 mL上述已处理好的样品溶液，用25 mL水洗柱，弃去洗脱液，再用25 mL 70%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，置于60 ℃水浴挥干，以此作显色用。在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加入0.8 mL高氯酸，混匀后移入10 mL带塞刻度离心管中，60 ℃水浴上加热10 min，取出，冰浴冷却后，准确加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后，以1 cm比色皿于560 nm波长处与标准管一起进行比色。

2.1.1 对照品溶液制备及线性关系考察 精确称取人参皂苷Re对照品17.92 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL，即每1 mL含人参皂苷Re 1.745 mg。吸取上述人参皂苷Re标准溶液25、50、75、100、125 μL置蒸发皿中，于60 ℃水浴挥干，加水适量溶解残渣，以下操作从“柱层析”起，与样品相同，测定吸光度值。以浓度(μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为：Y=0.00428X-0.01892，相关系数r=0.999 7。结果表明，人参皂苷Re在43.62～218.1 μg范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度试验 取标准曲线第3点显色后的溶液，连续测定6次吸光度，计算平均吸光度为0.553，RSD为0.093%。结果表明，精密度良好。

2.1.3 加样回收率试验 精密称取6份样品(编号：1)，每份约0.125 g，分别精密加入人参皂苷Re标准溶液(1.745 mg·mL-1)1.5 mL，按上述试验方法进行处理，测定吸光度，计算平均回收率为92.5%，RSD为2.6%。结果表明，回收率良好。

2.1.4 重复性试验 精密称取6份样品(编号：1)，每份约0.25 g。按上述试验方法进行处理，测定吸光度，计算总皂苷平均含量为2.20%，RSD为2.0%。结果表明，重复性良好。

2.1.5 检出限 参照GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》中附录A.2.2规定，检出限为3倍空白值的标准偏差(测定次数n≥20)相对应的质量，吸光法按国际理论与应用化学家联合(IUPAC)规定。检出限按下式进行计算：检出限=Ks/b；b—标准曲线回归方程中的斜率；s—20次空白值的标准偏差；K—一般为3。计算检出限为2.4 μg。

2.1.6 样品测定 按上述试验方法，对26批不同产地的红参样品中总皂苷含量进行测定。结果显示，总皂苷含量为1.2%～3.0%，说明不同产地红参的总皂苷含量存在差异，这与文献报道结果基本一致。具体结果见表1。

表1 红参药材总皂苷测定结果

方法学验证试验表明，紫外可见分光光度法测定红参中总皂苷的方法精密度好，重现性高，方法专属性强。

2.2 红参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量的测定 方法：取红参样品粉末(过四号筛)约l g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3 h，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100 mL锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50 mL，密塞，放置过夜，超声处理(功率250 W，频率50 kHz)30 min，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Hypersil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；检测波长：203 nm；柱温：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样体积：10 μL；乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表进行梯度洗脱。

表2 梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液制备及线性关系考察 取人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含人参皂苷Rg1、Re、Rb1各1 000 μg的混合标准溶液。分别精密量取混合标准溶液0.1、0.4、1、2、5、10 mL加甲醇定容到10 mL，制备标准曲线，即得。按上述色谱条件，注入液相色谱仪，测得峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品浓度(μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程分别是：人参皂苷Rg1为Y=3 945.08X+1 099.92，相关系数r=0.999 9；人参皂苷Re为Y=3 312.86X-1 659.22，相关系数r=0.999 9；人参皂苷Rb1为Y=2 753.65X+3 564.87，相关系数r=0.999 9。结果表明，人参皂苷Rg1在8.574 7～857.47 μg·mL-1，人参皂苷Re在10.393～1 039.3 μg·mL-1，人参皂苷Rb1在9.754 2～975.42 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.2.3 精密度试验 取每1 mL含人参皂苷Rg1、Re、Rb1各0.2 mg的混合标准溶液，按上述色谱条件重复进样6次，计算平均峰面积，分别是人参皂苷Rg1为645 177，RSD为0.53%；人参皂苷Re为652 791，RSD为0.61%；人参皂苷Rb1为516 661，RSD为0.60%。结果表明，精密度良好。

2.2.4 稳定性试验 取混合标准溶液，按上述色谱条件分别于0、2、4、8、12、24 h进样，计算平均峰面积，分别是人参皂苷Rg1为685 611，RSD为0.24%；人参皂苷Re为693 030，RSD为0.31%；人参皂苷Rb1为546 901，RSD为0.18%。结果表明，各组分在24 h内稳定。

2.2.5 加样回收率试验 精密称取同一编号红参样品9份，每份约0.5 g，低、中、高浓度水平各3份。分别精密加入人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，按上述试验方法和色谱条件测定峰面积，计算平均回收率，分别是人参皂苷Rg1为101.3%，RSD为0.46%；人参皂苷Re为102.0%，RSD为1.3%；人参皂苷Rb1为98.9%，RSD为1.4%。结果表明，各组分回收率良好。

2.2.6 重复性试验 精密称取同一编号红参样品6份，每份约1 g。按上述试验方法和色谱条件测定峰面积，计算平均含量，分别是人参皂苷Rg1为0.314%，RSD为0.57%；人参皂苷Re为0.155%，RSD为0.48%；人参皂苷Rb1为0.501%，RSD为0.53%。结果表明，重复性良好。

2.2.7 样品测定 按上述试验方法，对26批不同产地的红参样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量进行测定。结果显示，人参皂苷Rg1、Re总量在0.17%～0.61%，人参皂苷Rb1含量在0.21%～0.81%，说明不同产地红参的3种人参皂苷含量存在差异，这与文献报道结果基本一致。具体结果见表3。

表3 红参药材3种人参皂苷测定结果

方法学验证试验表明，高效液相色谱法测定红参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1方法精密度好，重现性高，方法专属性强。

3 讨论

3.1 《中国药典》2015年版(一部)红参规定，本品按干燥品计算，含人参皂苷Rg1和人参皂苷Re的总和不得少于0.25%，人参皂苷Rb1不得少于0.20%。本文26批红参药材中有1批含量低于限值规定，合格率为96.2%。所测结果最大比值为3.9倍，显示含量差异较大，这可能与红参的产地、参龄、加工炮制等有关，需要进一步加以研究。

3.2 GB/T 22538-2018《红参分等质量》规定，本品按干燥品计算，人参总皂苷≥2.00%。本文26批红参药材中有11批含量低于限值规定，合格率为57.7%。合格率较低的原因可能是不同产地的红参药材本身质量存在差异；另外总皂苷没有统一的国标检测方法，不同检测方法也可能导致结果的差异。GB/T 22538-2018《红参分等质量》非强制性国家标准，而《中国药典》2015年版(一部)红参未规定总皂苷指标。建议对红参中总皂苷指标加以控制，能更加全面客观地反应红参的内在质量。

3.3 本文26批红参药材中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1含量之和与总皂苷含量的比值为0.32～0.57，平均比值为0.45，结果显示，这3种单体人参皂苷在红参皂苷类成分中只占一部分。红参中除了与鲜参、生晒参共有的皂苷成分(如人参皂苷Ro、Rc、Rd、Rf等)外，还含有一些特有皂苷成分(如人参皂苷Rh1、Rh2、Rg3、Rg5、Rg6等)，需要进一步的研究。