一测多评法同时测定山苦荬中3 种成分

黄健军，梁 爽*，甘洋萦，陈洁银，刘真亦

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.玉林市食品药品检验检测中心，广西 玉林 537000）

山苦荬Ixeridium chinense(Thunb.) Tzvel.为菊科小苦荬属多年生草本植物,又名中华苦荬菜、山苦菜、小苦菜等,主要分布在北部、南部及东部省区,全草入药,既可药用又可食用,具有清热解毒、消炎凉血、止痛消肿、抗肿瘤等功效,用于治疗无名肿痛、腹腔脓肿、痢疾、阑尾炎、肺炎、关节炎等症［1-2］。现代药理学研究表明古羊藤有多种潜在的抗肿瘤、抗氧化、抗烟碱、抗病毒、降血脂、降血糖等活性［3-4］。山苦荬成分主要包含倍半萜类、三萜类、甾醇类、黄酮类等［4-7］。山苦荬作为广西民间传统瑶药,其野生资源非常丰富,有报道对山苦荬中木犀草苷、绿原酸的含量进行测定［8-9］。经查阅文献,当前国内外尚未见报道一测多评法同时测定山苦荬中绿原酸、咖啡酸和木犀草苷的含量。一测多评法基于多指标质量控制的研究思路,近年来获得了业内专家学者的共识,只使用一个对照品实现对多种成分的同步测定,既降低了检测成本,同时更简便、全面地对中药进行质量控制,提高了同步测定多种成分的工作效率［10-12］。基于上述因素,本研究拟对山苦荬的质量标准进一步完善,通过一测多评建立专属性强的含量测定方法,建立与目前检测技术相匹配的质量标准,以期为有效评价和控制山苦荬药材质量及该药材资源的开发提供参考。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)；U3000 高效液相色谱仪(美国Thermo Fisher公司)；XS-205Du 型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo 公司)；KQ-500GDV 超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；501 超级恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；Synergy 超纯水(美国Millipore 公司。山苦荬药材采自广西各地区,药材来源主要是采购和野外采集,具体见表1,经广西中医药大学韦松基教授鉴定为菊科小苦荬属植物中华小苦荬Ixeridium chinense(Thunb.) Tzvel.的全草。绿原酸(110753-201415,纯度96.2%)、咖啡酸(110885-200102,纯度100%)、木樨草苷(111720-201307,纯度94.0%) 均购自中国食品药品检定研究院。乙腈、甲醇(色谱纯,美国Fisher 公司)；磷酸(优级纯,批号20150327,天津市光复精细化工研究所)；高效液相色谱议用水为超纯水,其他所用试剂均为分析纯。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 色谱条件 TYPE MGⅡSIZE-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流动相甲醇-0.2%磷酸,梯度洗脱,程序见表2；体积流量1.0 mL/min),梯度洗脱；柱温25 ℃；检测波长330 nm。

表2 梯度洗脱程序Tab.2 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取对照品绿原酸11.59 mg、咖啡酸6.72 mg、木樨草苷13.60 mg,分别置于不同的25 mL 量瓶中,加适量甲醇超声(500 W,40 kHz) 溶解并稀释至刻度,摇匀,再分别精密量取上述相应对照品溶液1.5、1.5、6.0 mL,置同一10 mL 量瓶中并用甲醇定容,摇匀,即得。

2.2.2 供试品溶液 取山苦荬样品约2 g,精密称定,置于100 mL 锥形瓶中,精密加入70% 甲醇30 mL,称定质量,超声(500 W,40 kHz) 提取60 min,放冷,用70% 甲醇补足减失的质量,滤过,取续滤液过0.45 μm 微孔滤膜,即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性与专属性试验 分别精密吸取混合对照品、供试品溶液各5 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样,供试品溶液中绿原酸、咖啡酸和木犀草苷色谱峰与对照品色谱峰保留时间一致,并与其他共存成分的分离度大于1.5,理论塔板数不低于5 000。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL,分别置2.0 mL 量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,摇匀,制成系列混合对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,以目标峰峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),进行回归,得绿原酸、咖啡酸、木樨草苷回归方程分别为Y=0.288X+0.057 (r=0.996 8)、Y=0.467X+0.034(r=0.997 1)、Y=0.174X+1.571 (r=0.991 2),各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验 取山苦荬样品(S4 号) 约2 g,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下连续进样6 次,测得绿原酸峰面积平均值为15.62,RSD 为2.0%；咖啡酸峰面积平均值为5.47,RSD 为2.1%；木樨草苷峰面积平均值为31.04,RSD 为2.1%,表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取S4 号山苦荬样品6 份,每份约2 g,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,测得绿原酸含量平均值为1.17 mg/g,RSD 为1.7%；咖啡酸含量平均值为0.21 mg/g,RSD 为2.3%；木樨草苷含量平均值为2.51 mg/g,RSD 为2.3%,表明该方法重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取“2.3.4” 项下制备的供试品溶液,在“2.1” 项色谱条件下,分别于0、2、4、8、12、24 h 进样,测得绿原酸含量平均值为1.15 mg/g,RSD 为5.1%；咖啡酸含量平均值为0.21 mg/g,RSD 为4.8%；木樨草苷含量平均值为2.41 mg/g,RSD 为5.1%,表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已测定含量的山苦荬样品6 份,每份约1 g,精密称定,另精密称取对照品绿原酸6.86 mg、咖啡酸1.34 mg、木樨草苷16.24 mg,置200 mL 量瓶中,加适量70%甲醇超声使溶解,并稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品贮备液。分别精密加入混合对照品贮备液30 mL,按“2.2” 项下方法制备供试品溶液,在“2.1”项色谱条件下进行测定,记录山苦荬加样回收样品溶液中绿原酸、咖啡酸、木樨草苷的峰面积并计算回收率,结果见表3。

2.4 相对校正因子计算 精密吸取“2.2.1” 项下混合对照品溶液,依法测定咖啡酸、木樨草苷的峰面积,以绿原酸为内参物,按照相对校正因子计算公式［fsi=fs/fi=(As/Cs)/ (Ai/Ci)］ (式中As为内参物绿原酸对照品峰面积,Cs为内参物绿原酸对照品浓度,Ai为待测成分咖啡酸或木樨草苷对照品峰面积；Ci为待测成分咖啡酸或木樨草苷对照品浓度。) 计算常咖啡酸、木樨草苷的相对校正因子,结果见表4。

表3 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents （n=6）

表4 各成分相对校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.5 系统耐用性考察

2.5.1 进样量 精密吸取“2.2.1” 项下混合对照品溶液,在“2.1” 项色谱条件下进样,考察4、5、6 μL 不同进样量对相对校正因子的影响。结果显示,不同体积流量对相对校正因子影响程度不明显,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子值的RSD 分别为0、0.2%,相对保留时间RSD 均为0。表明该方法耐用性良好,结果见表5。

2.5.2 仪器、色谱柱 选择ThermoU3000 高效液相色谱仪、Agilent 1260 高效液相色谱仪,以及YPE MGⅡSIZE -C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)、Agilent Eclipse plus-C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm)、WatersAtlantis T3色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)考察不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响。结果显示,不同仪器、色谱柱对相对校正因子影响程度在可接受范围内,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子RSD 分别为2.4%、1.1%,结果见表6。

表5 不同进样量的相对校正因子Tab.5 Relative correction factors or different injection volumes

表6 不同仪器、色谱柱对相对校正因子的影响Tab.6 Effects of different instruments and chromatographic columns on relative correction factors

2.5.3 体积流量 精密吸取“2.2.1” 项下混合对照品溶液5 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样测定,考察0.9、1.0、1.1 mL/min 体积流量对相对校正因子的影响。结果显示,不同体积流量对相对校正因子影响程度不明显,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子RSD 分别为0.3%、0.12%,相对保留时间RSD 分别为1.2%、5.1%,结果见表7。

表7 不同体积流量对相对校正因子的影响Tab.7 Effects of different volume flow rate on relative correction factors

2.5.4 柱温 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液5 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样,考察20、25、30 ℃不同柱温对相对校正因子的影响。结果显示,不同柱温对相对校正因子影响程度不明显,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子RSD 分别为0.3%、0.5%,相对保留时间RSD 分别为1.0%、4.2%,结果见表8。

表8 不同柱温对相对校正因子的影响Tab.8 Effects of different column temperature on relative correction factors

2.5.5 检测波长 精密吸取“2.2.1” 项下对照品溶液5 μL,在“2.1” 项色谱条件下进样,考察220、254、330 nm 检测波长对相对校正因子的影响。结果显示,不同检测波长对相对校正因子影响程度不明显,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子RSD 分别为1.3%、5.7%,相对保留时间RSD 均为0,结果见表9。

表9 不同检测波长对相对校正因子的影响Tab.9 Effects of different detection wavelength on relative correction factors

2.6 待测色谱峰定位 分别考察相对保留值和保留时间差在不同仪器、色谱柱中的重复性,结果见表10。由表可知,咖啡酸和木犀草苷相对校正因子值波动较小,RSD 分别为1.4%、6.8%,故选择绿原酸作为色谱峰定位指标。

表10 不同仪器、色谱柱相对保留值的影响Tab.10 Effects of different instruments and chromatographic columns on relative retention values

2.7 一测多评法与外标法比较 经方法学优化和考察后,对10 批样品提取物中的咖啡酸、木犀草苷的含量进行测定,为了考察一测多评方法的准确性,把一测多评法的测定结果与外标法测定结果进行比较,结果见表11。由此显示,绿原酸含量较高的产地为S10、S6、S4,咖啡酸含量较高的产地为S10、S5、S6、S4、S2,木樨草苷含量较高的产地为S10、S5、S4、S6,表明S10、S6、S4 的山苦荬绿原酸、咖啡酸和木犀草苷的含量较高。

3 讨论

参考文献［13-18］,本实验分别选用0.1%磷酸-乙 腈、0.1% 磷 酸-甲 醇、0.2% 磷 酸-乙 腈、0.2%磷酸-甲醇、水-甲醇等；用0.1%磷酸时由于出峰时间迟,分离效果差,故排除0.1%磷酸；在选用乙腈和甲醇时,由于乙腈在分离时锋形较窄且分离效果较差,出来的峰也较少；由于水的极性较大,所以考虑加酸,选择0.2%磷酸-甲醇采用梯度洗脱时分离效果较好。分别考察了不同浓度甲醇、不同料液比、不同提取方法、不同提取时间,发现用70%甲醇超声提取后所得到的峰基线平稳,色谱图中检测成分较多且峰形较好。用70% 甲醇不同体积进行测定,发现30 mL 所提取出来的含量较高。进一步用70%甲醇30 mL 分别用回流和超声提取,发现两者结果误差不大,为了节省时间,故选择回流。以70% 甲醇为提取溶剂提取30～120 min,结果发现60 min 时提取含量最高。本实验对确定的对照品和药材粉末以确定的色谱条件进行全波长扫描时发现在330 nm 均有最大吸收峰,保留时间一致,基线较平稳,色谱峰形较好,故选择其作为检测波长。

表11 一测多评法和外标法所得结果比较（mg/g）Tab.11 Comparison of results obtained by QAMS method and external standard method （mg/g）

山苦荬中由于成分较多,在现有对照品的条件下所测得3 个含量中绿原酸对照品较易购买,且实验发现,以绿原酸为内标物,在不同仪器和色谱柱上的保留时间差波动较小,均在5%以内,由于咖啡酸含量较低,不宜进行系统性分析,而木樨草苷的保留时间大于5%,不宜进行待测组分色谱峰的定位。故选择绿原酸作为内标。本实验考察了不同仪器、色谱柱、体积流量、柱温、检测波长对各成分相对校正因子的重复性,用于验证一测多评法在山苦荬质量控制中的可行性和技术适应性。结果表明,不同条件下相对校正因子的重复性均较理想。

针对在只使用单一对照品如何正确定位山苦荬中所测得其他2 种成分色谱峰的问题,选择各成分之间的保留时间差、相对保留值、分离度作为定位标准,并在不同仪器、色谱柱下对二者进行考察。结果表明,相对保留值能更精准地定位色谱峰。本实验建立一测多评法同时测定山苦荬绿原酸、咖啡酸和木樨草苷的含量。该方法简单、快速、准确,相对校正因子具有良好的可信度和准确度。能在对照品短缺的情况下用于含量测定,同时可减少溶剂消耗和分析时间,更有利于环境保护。