1例输入性HIV-1 G亚型毒株的检出及基因组序列分析

杜 波，李 贺，罗周正，马玉霞，刘文新，赵 地，吴 莹，郭 勇，田晓东

HIV-1为反转录病毒属正链RNA病毒，由于病毒复制过程缺少校对功能，具有高度变异性。HIV-1除少数为N组和O组外，大部分属于M组，而M组又可分为9个亚型和102个重组亚型[1-2]。随着基因测序技术的进步，越来越多的HIV基因组得到测序，这为分析HIV亚型、流行趋势、分子溯源提供基础数据，也对制定有效的艾滋病防治措施提供科学依据[3-5]。HIV-1亚型中，G亚型主要分布于西非和欧洲，其感染者只占全球感染者的4.6%；但G亚型出现时间较长，随着病毒的变异和重组，G亚型与HIV-1其他亚型重组产生的重组亚型广泛流行。例如，重组亚型CRF02_AG就是由HIV-1 A亚型和G亚型重组而成，CRF02_AG重组亚型感染者占全球感染者的7.7%[6]。

阜新地区流行的HIV-1毒株亚型呈现复杂趋势。2009年以前，主要以B亚型感染为主；2009年以后，以CRF01_AE亚型感染居多，亚型种类包括B亚型、CRF07_BC亚型和CRF65_cpx亚型，但之前本地区未发现过G亚型。在2019年的艾滋病监测中，首次监测到本地区有1例输入性HIV-1 G亚型感染者，本文对其体内的HIV-1基因组进行序列测定和进化分析，为本病例病毒溯源提供依据，也为本地区HIV-1流行趋势提供预测。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 对象 本病例来自阜新市卫生健康服务中心（阜新市疾病预防控制中心）艾滋病监测人群，为艾滋病WHO临床分期I期的尼日利亚来华人员，血清样本编号FX2019042，经ELISA、胶体金筛查和免疫印迹确证试验确认为HIV-1抗体阳性。在确保患者知情同意的前提下，采集患者血清2 ml，冻存于-70 ℃冰箱备用。

1.2 HIV-1 RNA提取 采用RNA病毒提取试剂盒QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN公司，货号52904）提取血清样品中的HIV-1 RNA，具体操作严格按照说明书进行。提取的RNA冻存于-70 ℃冰箱备用。

1.3 HIV-1 RT-PCR扩增 由于样本珍贵，先将病毒RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板，进行两轮PCR，最后进行测序。反转录反应按照试剂盒说明书进行。反应过程简述如下。RT-PCR反应体系总体积50 μl，体系成分包括：1 μl反转录酶（0.5 U/μl）、25 μl 2× 缓冲溶液，10 μl模板RNA，5 μl随机引物及 2 μl dNTP，用水补足至50 μl。反转录反应条件为 50 ℃温育50 min，85 ℃5 min终止反应。用2×Taq PCR Master Mix试剂盒（日本TaKaRa公司）进行第一轮PCR扩增，其PCR产物为近似全长基因组，上游引物为UFA，下游引物为URB。PCR反应体系总体积50 μl，体系成分包括：25 μl 2×Taq PCR Master Mix混合液、2 μl cDNA 模板、2 μl上下游引物（10 μmol/L），用水补足至 50 μl。PCR反应条件如下：95 ℃ 10 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，70 ℃ 10 min，进行 40 个循环；终延伸72 ℃ 10 min。用2×Taq PCR Master Mix试剂盒（日本TaKaRa公司）进行第二轮巢式PCR扩增，反应体系和条件同第一轮PCR反应。所有引物序列见表1。

表1 RT-PCR 引物序列表Table 1 Sequence of RT-PCR primers

1.4 PCR产物的纯化和测序 PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，对目的条带切胶回收，使用QIAGEN公司（德国）QIAquick Gel Extraction Kit对切胶产物进行纯化，纯化后的产物委托Invitrigen公司进行DNA测序。

1.5 序列分析 用Chromas软件查看测序序列峰图，序列编辑使用Sequencher 4.0软件，最后用BioEdit 6.1软件对序列进行拼接，基因位置的绘图和分析采用HIV Sequence Locator软件。从HIV Database （https://www.hiv.lanl.gov）下载HIV-1各亚型参考毒株基因组序列，使用MEGA 6.0软件构建Neighbor-Joining系统进化树，计算参数设定为Bootstrap值500次。在GenBank中下载所有G亚型基因组序列，利用NCBI BLAST在线比对G亚型各基因与本研究毒株各基因相似度。对获得的基因组序列，使用RIP 3.0软件进行基因重组分析，并将序列中env基因C2V3区序列应用Gene Cutter软件搜索并翻译为氨基酸序列。所得到的氨基酸序列使用Geno2pheno软件进行辅助受体预测，辅助受体判定标准：假阳性率＜5%判定为病毒使用趋化性细胞因子受体4（chemokine cysteine-X-cysteine motif receptor 4,CXCR4）为辅助受体；5%～15%判定为趋化性细胞因子受体5（chemokine cysteinecysteine motif receptor 5,CCR5）/CXCR4双嗜性辅助受体；＞15%判定为CCR5为辅助受体。

1.6 统计学处理 采用EpiData 3.1 软件录入数据，采用SPSS 23.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示。

2 结 果

2.1 近似全长基因组分析 经过测序，所获得的7个片段经拼接后，序列全长为8695 bp。基因组中，4种碱基分别为：3199A、1491C、2071G、1934T，嘌呤（A+G）占 60.6%（5270/8695），毒株符合反转录病毒基因组碱基组成特征，将此毒株编号为FX2019042。经HIV Sequence Locator软件分析，FX2019042 从 5´-3´分 别 为 gag、pol、vif、vpr、tat、vpu、env、rev和 nef共 9个基因，参照HIV-1标准毒株HXB2，FX2019042毒株的序列位置见图1。

图1 FX2019042毒株基因序列位置图Figure 1 FX2019042 strain gene sequence location map

2.2 系统进化分析 在HIV Database中下载A～D、F～H、J～K各亚型及其常见重组亚型的参考株全长序列，使用Kimura2-parameter模型，绘制Neighbor-Joining系统进化树（见图2）。FX2019042毒株与G亚型参考株G.KE.1993.HH8793基因离散率为9.96%，并与其他G亚型参考株亲缘关系相近，Bootstrap值为98%，提示该毒株为G亚型毒株。

图2 FX2019042毒株与各亚型参考株全长序列进化分析★.FX2019042毒株Figure 2 Full-length sequence phylogenetic tree of FX2019042 and reference strains of each subtype

为了在分子生物学上进一步确定FX2019042毒株的来源，将GenBank中6株国内G亚型毒株和17株国外G亚型毒株与FX2019042一起绘制进化树。结果显示，我国的G亚型呈散在分布，FX2019042毒株与尼日利亚流行株G.NG.1995.NG1937.AF069937亲缘关系最近，基因离散率为8.95%（见图3）。GenBank中G亚型HIV基因组序列共142条，将FX2019042毒株的3个结构基因和6个非结构基因序列分别与G亚型HIV基因组中各基因比对，获得相似度分值，基因序列相似度比较结果见表2。结果显示，FX2019042毒株发生变异最大的主要基因为结构基因env和非结构基因tat。

图3 FX2019042毒株与G亚型参考株进化分析★.FX2019042毒株；●.与FX2019042毒株亲缘关系最近的G亚型毒株；△.国外G亚型毒株；▲.国内G亚型毒株Figure 3 Phylogenetic tree of FX2019042 strain and subtype G reference strain

表2 FX2019042毒株各基因与G亚型各基因序列相似度比较Table 2 Comparison of sequence similarity between each gene of FX2019042 strain and each gene of G subtype

2.3 基因重组分析 为了检测FX2019042毒株基因组是否存在重组片段，我们使用在线软件RIP3.0对FX2019042毒株进行重组分析，参数设置：windowsize=400，confidence threshold=90%，gapoption=3，multistate characters=yes。FX2019042毒株基因组序列重组分析结果见图4。结果显示，未发现FX2019042毒株基因组序列与HIV-1的A～D、F～H、J～K的9个亚型发生重组，提示该毒株为纯粹的HIV-1 G亚型毒株。

图4 FX2019042毒株基因重组分析X轴表示序列在移动的窗口中心的位置；Y轴表示与参考毒株相似程度Figure 4 Analysis of FX2019042 strain gene recombination

2.4 糖蛋白GP120分析 GP120的糖基化过程对于蛋白质的折叠至关重要，在HIV感染人体T淋巴细胞过程中，GP120通过糖基化使病毒吸附于T淋巴细胞，而且HIV可以利用糖基来阻塞抗体表位而逃避人体免疫系统。含511个氨基酸的GP120中，V1～V5为可变区，C1～C5为恒定区。对FX2019042毒株的GP120的可变区和糖基化程度进行分析，结果显示FX2019042毒株V3区有1个氨基酸缺失，在GP120区域共有25个糖基化位点，但其中8个位点因多糖空洞而导致糖基化位点缺失（见图5）。在辅助受体方面，对V3区关键氨基酸的分析显示，FX2019042毒株V3区氨基酸序列为CVRPNNNTRRSIHFGPGQA IYTTGIIGDIRQAHC，预测此毒株利用 CCR5作为辅助受体。

图5 FX2019042毒株GP120糖基化位点预测黄色部分代表缺失的糖基化位点Figure 5 Prediction of GP120 glycosylation sites of FX2019042 strain

3 讨 论

HIV-1 G亚型为古老的HIV-1亚型，在全球的流行分布极不平衡，主要集中在西非的尼日利亚和喀麦隆等地区。而G亚型与其他亚型重组形成的重组亚型则广泛分布[6-7]，在我国常见的为CRF02_AG流行重组型，在世界范围内，虽然G亚型感染者只占全部HIV-1感染者的5.0%，但CRF02_AG感染者占全部HIV-1感染者的7.7%。在G亚型的发源地西非地区，67%的HIV-1感染者中能检测到G亚型基因片段[7]，可见G亚型毒株极易与其他毒株发生重组并获得传播优势，需要加强对本地区的HIV流行株严密监测，防止新型重组毒株的出现及流行。

我国发现的HIV-1 G亚型毒株较少，仅重庆、上海和广西有相关报道[3，8-9]。我国在重庆市首次检测到G亚型毒株[8]，根据HIV传统分型基因env，鉴定为G亚型，但是由于只测序了env基因的686 bp，无法排除此毒株为CRF02_AG重组亚型的可能[3，9]。在2019年的艾滋病监测中，本课题组发现了1例HIV-1 G亚型毒株，对其进行基因组测序，RIP 3.0软件分析显示FX2019042为纯G亚型，构建的系统进化树显示FX2019042毒株与尼日利亚毒株亲缘关系最近，与在广西等地发现的G亚型毒株亲缘关系较近[3，10]，但与上海分离株sh52亲缘关系较远，推测FX2019042毒株为境外输入型毒株。

HIV-1感染人体细胞除了需要与CD4+T淋巴细胞受体结合外，还需要env基因编码的辅助受体CCR5和CXCR4[1，11-12]。这两种受体为HIV-1进入人体细胞的主要辅助受体，在艾滋病不同时期HIV-1使用的辅助受体不同，在HIV-1感染早期，体内病毒准种常以CCR5为辅助受体，随着病情进展，病毒利用的辅助受体向CXCR4过渡，在感染晚期则利用CXCR4辅助受体[1，3-15]。由于GP120的糖基化过程对于HIV-1感染细胞至关重要，而且HIV可以利用糖基来阻塞抗体表位而逃避机体免疫功能[12，15]，所以本研究在基因序列分析基础上，对FX2019042毒株的GP120可变区和糖基化程度进行分析，结果显示，FX2019042毒株准种进入CD4+T淋巴细胞时利用的辅助受体为CCR5，这与该患者病程为艾滋病发病早期相符。

综上，本研究对艾滋病监测获得的HIV-1 G亚型近似全长基因组序列进行研究，从分子流行病学角度证实该毒株为境外输入型毒株，这与该感染者流行病学史相符。此毒株序列的测定和分析对于本地区HIV流行趋势和HIV毒株多样性研究均具有重要意义，提示我们需加强艾滋病监测，防止境外毒株与本地毒株发生重组和流行。