纳米二氧化钛对浮萍生长和生理特征的影响

刘爽，郭雪莲，郑荣波，范峰华

1. 云南省高原湿地保护修复与生态服务重点实验室，昆明 650224 2. 西南林业大学，昆明 650224 3. 国家高原湿地研究中心，昆明 650224

纳米材料是指任何一维几何尺寸处于纳米尺度(1～100 nm)，并具有特殊物理和化学性能的材料[1]。由于其特殊的物理化学性质，如尺度效应、表面界面效应和量子隧道效应，它们被广泛使用[2-3]。纳米二氧化钛(TiO2-NPs)是最常见的纳米金属氧化物，在平时的生产应用中无法避免地以各种途径和方式流入到环境中[4]。研究表明，美国污泥中TiO2-NPs的含量约为137 mg·kg-1[5]，亚利桑那州污水中TiO2-NPs的含量为181～1 233 μg·L-1[6]。这些进入环境系统的TiO2-NPs将通过富集影响生物活性，引起潜在的生物毒性和危害生态环境等。

由于TiO2-NPs的加入，引起活性氧含量变化，超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢自由基这些活性氧(ROS)通过影响细胞内的生理活动，对细胞和基因产生毒性作用[7-9]。目前，已有大量实验证明TiO2-NPs会对生物产生毒性效应。哺乳动物细胞在不同浓度TiO2-NPs颗粒的作用下会发生基因突变、姐妹染色单体交换等异常现象，表明TiO2-NPs会对哺乳动物细胞产生基因毒性[10-12]。其他的一些研究表明，TiO2-NPs也会加速哺乳动物的细胞凋亡，产生细胞毒性[11-13]。植物是生态系统的生产者，在生态系统中的作用至关重要，同时也是动物和人类的主要食物来源，是毒性物质蓄积的起点[14]，植物的生长生理活动与纳米颗粒的迁移转化密切相关[15]。目前，关于TiO2-NPs在生物毒性方面的研究主要集中在其对动物的毒害效应，对植物的研究主要为考察TiO2-NPs对植物生长方面的影响，例如，王一翔[16]研究TiO2-NPs对三角褐指藻的毒性效应时发现TiO2-NPs对三角褐指藻具有一定的生长抑制作用；兰丽贞等[17]研究环境中TiO2-NPs对拟南芥生长及相关基因表达的影响时发现TiO2-NPs可以减缓拟南芥种子的萌发，抑制拟南芥生长。而TiO2-NPs影响植物生长的相关机理鲜见研究报导。

水生植物是水生生态系统的重要组成部分和主要初级生产者，在环境化学物质的积累、代谢等过程中具有不可忽视的作用。浮萍作为一种漂浮水生植物，具有个体小、繁殖快和数量大等优点，广泛存在于水环境。TiO2-NPs暴露对浮萍的影响尚不清楚。本研究选取浮萍作为研究对象，研究TiO2-NPs对叶片数和叶面积、叶绿素含量和酶活性的影响。掌握TiO2-NPs对浮萍生长和生理特征的影响，为纳米颗粒对水生植物毒理研究提供理论基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料1.1.1 纳米材料

本实验选取的TiO2-NPs有3种晶型，即锐钛矿型、金红石型和P25混合型。本实验采用的TiO2-NPs购于阿拉丁试剂官网，平均粒径为21 nm；锐钛矿型，平均粒径10～25 nm，亲水；金红石型，25 nm，亲水。

1.1.2 浮萍(Lemnaminor)

漂浮植物，褶皱对称，绿色表面，背面通常淡黄色、或带绿白色、或为紫色，近圆形、倒卵形或倒卵状椭圆形；北方和南方省份均有分布，生于稻田、池塘或其他静水中，经常与紫萍(Spirodelapolyrrhiza)混合，在水面上形成一个漂浮群落。

1.2 研究方法

浮萍(Lemnaminor)采集于昆明市捞鱼河湿地公园。

预培养：首先用0.05%的NaClO溶液浸泡5 min，然后用去离子水彻底清洗，再加入1/2 STEINBERG总营养液(表1)，培养15 d(恒温培养箱内)。pH为5.5±0.2，昼夜温度比为25 ℃∶25 ℃，昼夜时长比为12 h∶12 h，光照度为200 μE·m-2·s-1，相对湿度为65%。

培养：称取3种不同晶型的TiO2-NPs各0.2 g分别移入2 L的容量瓶中，用已经配好的营养液定容，作为储备液备用。超声45 min后稀释至实验所需浓度(0、25、50、75和100 mg·L-1，分为记为对照组、T25、T50、T75和T100)，再超声45 min (200 V，50 kHz)，随后准确量取300 mL倒入750 mL的培养容器中，每个浓度分别设3个平行组。挑选健康且大小一致的浮萍4株(12叶)放至培养容器中，培养条件与预培养条件相同，每天搅动3次，每次均匀搅拌至培养液无沉淀物质，每24 h更换一次培养液，共培养7 d。测定叶面积、叶片数、叶绿素含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性和过氧化氢酶(CAT)活性。

1.3 实验测定1.3.1 叶面积和叶片数的测定

叶片数测定：将单反相机保持同一高度、同一焦距，每24 h对浮萍进行拍照，分别计数对照组和处理组的叶片数。叶面积测定采用Image J 软件分析。

1.3.2 叶绿素含量的测定

待培养时间结束后取样(约取叶片0.1 g，加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF))后在4 ℃下避光提取24 h，然后进行离心取上清液，以DMF为对照测定其在波长为647 nm和664.5 nm的吸光度(OD)值[18]。叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量计算公式如下：

m叶绿素a=[12.7×OOD664.5]-[2.79×OOD647]

(1)

m叶绿素b=[20.7×OOD647]-[4.62×OOD664.5]

(2)

m总叶绿素=17.9×OOD647+8.08×OOD664.5

(3)

1.3.3 酶活性测定

SOD活性测定采用NBT光还原法[19]：SOD活性(U·g-1·h-1)=(A0-As)×Vt×60/A0×0.5×mFW×Vs×t

(4)

POD活性测定采用愈创木酚法[20]：POD活性(μg·g-1·min-1)=(X-X0)×Vt/mFW×Vs×t

(5)

CAT活性测定采用紫外线吸收法[17]：CAT活性(U·g-1·min-1)=0.1×Vs×t×mFW

(6)

式中：mFW为样品鲜质量(g)；A0为对照组吸光度；As为实验组吸光度；Vt为提取液总体积(mL)；Vs为测定用提取液体积；t为显色反应时间；X为测定管四邻甲氧基苯酚的含量；X0为对照管四邻甲氧基苯酚的含量。

表1 STEINBERG全营养液成分Table 1 STEINBERG total nutrient contents

1.4 数据处理

采用Excel 2016进行数据整理，采用SPSS 20对数据进行单因素方差分析、双因素方差分析和显著性检验，采用Origin 2018制图。

2 结果(Results)

2.1 TiO2-NPs输入对浮萍生长的影响

TiO2-NPs输入对浮萍叶片数的影响如图1(a)所示，T75锐钛矿型处理组浮萍叶片数显著增加(P<0.05)；T25、T50和T75金红石型处理组浮萍叶片数均显著增加(P<0.05)；不同浓度P25混合型处理组浮萍叶片数均显著增加(P<0.05)。T25和T50处理组浮萍叶片数表现为金红石型和P25混合型高于锐钛矿型(P<0.05)，T75处理组浮萍叶片数表现为金红石型<锐钛矿型

TiO2-NPs输入对浮萍叶面积的影响如图1(b)所示，不同浓度锐钛矿型处理组浮萍叶面积均无显著变化(P>0.05)；T25和T100金红石型处理组浮萍叶面积均显著降低(P<0.05)；P25混合型在T75处理组浮萍叶面积显著增加(P<0.05)。T75处理组浮萍叶面积表现为P25混合型高于金红石型和锐钛矿型(P<0.05)，T100处理组浮萍叶面积表现为金红石型<锐钛矿型

TiO2-NPs浓度和晶型均显著影响浮萍叶片数和叶面积(P<0.01)；浓度和晶型交互作用显著影响浮萍叶片数(P<0.01)(表2)，对浮萍叶面积影响不显著(P>0.05)。

2.2 TiO2-NPs输入对浮萍叶绿素含量的影响

TiO2-NPs输入对浮萍叶绿素a含量的影响如图2(a)所示，T25锐钛矿型处理组浮萍叶绿素a含量显著降低(P<0.05)，T75和T100金红石型处理组浮萍叶绿素a含量均显著增加(P<0.05)，不同浓度P25混合型处理组浮萍叶绿素a含量均显著增加(P<0.05)。T25和T100处理组浮萍叶绿素a含量均表现为锐钛矿型<金红石型

TiO2-NPs输入对浮萍叶绿素b含量的影响如图2(b)所示，T25和T50锐钛矿型处理组浮萍叶绿素b含量均显著下降(P<0.05)，而T75和T100金红石型处理组浮萍叶绿素b含量均显著下降(P<0.05)，不同浓度P25混合型处理组浮萍叶绿素b含量均无显著变化(P>0.05)。T25和T50处理组浮萍叶绿素b含量均表现为锐钛矿型低于金红石型和P25混合型(P<0.05)，T100处理组浮萍叶绿素b含量表现为锐钛矿型>P25混合型>金红石型(P<0.05)。

图1 TiO2-NPs对浮萍生长的影响注：T25、T50、T75和T100表示25、50、75和100 mg·L-1 TiO2-NPs；大写字母表示不同晶型TiO2-NPs处理组的差异显著性，小写字母 表示不同浓度TiO2-NPs处理组的差异显著性；不同字母表示其统计差异达到显著水平(P<0.05)，下同。Fig. 1 The effect of TiO2-NPs on the growth of Lemna minorNote: T25, T50, T75 and T100 stand for 25, 50, 75 and 100 mg·L-1 TiO2-NPs; the uppercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different crystalline TiO2-NPs, and the lowercase letters indicate the significance of the difference in the treatment of different concentrations of TiO2-NPs; different letters indicate that the statistical difference has reached a significant level (P<0.05); the same below.

图2 TiO2-NPs对浮萍叶绿素含量的影响Fig. 2 The effect of TiO2-NPs on chlorophyll of Lemna minor

表2 TiO2-NPs对浮萍生长和生理指标影响的双因素方差分析Table 2 Two-factor analysis of variance on the influence of TiO2-NPs concentration and crystal type on the growth and physiological indexes of Lemna minor

TiO2-NPs输入对浮萍总叶绿素含量的影响如图2(c)所示，T25和T50锐钛矿型处理组浮萍总叶绿素含量均显著降低(P<0.05)。T25、T50和T100金红石型处理组浮萍总叶绿素含量均显著下降(P<0.05)。P25混合型在T25处理组浮萍总叶绿素含量显著增加(P<0.05)。T25和T50处理组浮萍总叶绿素含量均表现为P25混合型高于锐钛矿型和金红石型(P<0.05)，T100处理组浮萍总叶绿素含量表现为金红石型<锐钛矿型

TiO2-NPs浓度、晶型、浓度和晶型交互作用均显著影响浮萍叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量(P<0.05)。

2.3 TiO2-NPs对浮萍抗氧化酶活性的影响

TiO2-NPs输入对浮萍SOD酶活性的影响如图3(a)所示，不同浓度锐钛矿型处理组浮萍SOD活性均显著增加(P<0.05)。T50和T100金红石型处理组浮萍SOD活性均显著增加(P<0.05)。P25混合型在T50处理组浮萍SOD活性显著增加(P<0.05)。不同浓度处理组浮萍SOD活性表现为3种晶型均无显著差异(P>0.05)。

TiO2-NPs输入对浮萍POD酶活性的影响如图3(b)所示，不同浓度锐钛矿型和P25混合型处理组浮萍POD活性均显著增加(P<0.05)。T50、T75和T100金红石型处理组浮萍POD活性均显著增加(P<0.05)。T50和T100处理组浮萍POD活性表现为锐钛矿型高于金红石型和P25混合型(P<0.05)，T75处理组浮萍POD活性表现为P25混合型高于锐钛矿型和金红石型(P<0.05)。

TiO2-NPs输入对浮萍CAT酶活性的影响如图3(c)所示，T75锐钛矿型处理组浮萍CAT活性显著增加(P<0.05)。T25金红石型处理组浮萍CAT活性显著下降(P<0.05)，T50金红石型处理组浮萍CAT活性显著增加(P<0.05)。P25混合型在T50处理组浮萍CAT活性显著下降(P<0.05)。T25和T75处理组浮萍CAT活性表现为锐钛矿型高于金红石型和P25混合型(P<0.05)，T50处理组浮萍CAT活性表现为金红石型高于锐钛矿型和P25混合型(P<0.05)。

TiO2-NPs浓度显著影响浮萍SOD和POD活性(P<0.01)，显著影响浮萍CAT活性(P<0.05)。TiO2-NPs晶型对浮萍SOD和CAT活性影响显著(P<0.05)，对浮萍POD活性影响显著(P<0.01)。浓度和晶型交互作用对浮萍SOD活性影响不显著(P>0.05)，显著影响浮萍POD和CAT活性(P<0.01)。

图3 TiO2-NPs对浮萍酶活性的影响注：SOD表示超氧化物歧化酶；POD表示过氧化物酶；CAT表示过氧化氢酶。Fig. 3 The effect of TiO2-NPs on enzyme activity of Lemna minorNote: SOD stands for superoxide dismutase; POD stands for peroxidase; CAT stands for catalase.

3 讨论(Discussion)

3.1 TiO2-NPs对浮萍生长的影响分析

具有不同晶体结构的同种纳米材料生物毒性不同。纳米颗粒的生物毒性与纳米颗粒的颗粒尺寸、比表面积等存在一定关联。一般认为，相同纳米颗粒的尺寸越小其生物毒性越强[21]。较小尺寸的纳米材料可以直接穿透植物细胞壁，因为细胞壁可能会限制>20 nm的纳米材料通过[22]。本研究发现锐钛矿型处理均对浮萍生长产生了不同程度的抑制作用，而金红石型和P25混合型处理对浮萍生长有促进作用。在成婕等[23]的研究中，锐钛矿型TiO2-NPs在10、20和40 mg·L-1处理下抑制了斜生栅藻的生长，且文双喜和王毅力[24]研究发现20 mg·L-1和100 mg·L-1锐钛矿型TiO2-NPs均抑制了金鱼藻的生长，这与本研究结果一致。这可能是由于锐钛矿型的粒径小于金红石型和P25混合型，较容易通过植物细胞壁进入细胞，同时通过物理阻塞作用使植物细胞壁孔径变小，从而影响植物细胞的正常生理功能，致使植物生长受到抑制[25]。而金红石型和P25混合型可能被浮萍细胞识别为生物大分子如蛋白质[26]，从而不被细胞排斥，且促进了植物生长。李雅洁等[27]的研究表明，金红石型TiO2-NPs在5 mg·L-1处理下对斜生栅藻生长有显著促进作用，可能是由于低浓度毒物的“刺激效应”或称“兴奋效应”所致[28-29]，对植物生长产生促进作用。

3.2 TiO2-NPs对浮萍叶绿素含量的影响分析

叶绿体是活性氧产生和积累的位点[30]，叶绿素是植物光合作用中吸收光能和传递光能的重要载体，对植物生长起着十分重要的作用。当植物暴露于纳米材料氧化胁迫下，叶绿素a和叶绿素b的含量会降低[31-32]，本研究发现不同浓度锐钛矿型处理降低了浮萍叶绿素的含量。已有研究表明，锐钛矿型TiO2-NPs在40 mg·L-1处理下降低了斜生栅藻叶绿素a的含量[23]，100 mg·L-1锐钛矿型处理显著降低普生轮藻叶绿素a含量[33]，这可能是TiO2-NPs胁迫直接破坏植物体内生成的解毒物质，形成大量的活性氧自由基，这些自由基直接把叶绿素作为靶分子，从而破坏植物生长[34]。武鹏鹏[35]研究发现30 mg·L-1锐钛矿型(10～25 nm)处理降低了斜生栅藻叶绿素a的含量，这与本研究结果一致。本研究还发现，随着浓度的增加锐钛矿型处理对浮萍叶绿素b含量抑制作用减弱，可能是浓度处理达到防御系统的刺激阈值时，藻体的防御机制启动，生成了相应的解毒物质[16]。锐钛矿型TiO2-NPs比金红石型TiO2-NPs有更强的毒性[36]，本研究中锐钛矿型处理降低了浮萍叶绿素a含量，而金红石型处理提高了浮萍叶绿素a的含量，且Hong等[37]的研究也显示了金红石型能加快希尔反应FeCy的氧化还原过程，增加了叶绿体活性，这可能是因为TiO2-NPs进入叶绿体，其氧化还原反应会加速电子传输和氧的释放。

3.3 TiO2-NPs对浮萍酶的影响分析

当植物体内的ROS积累到一定程度而没有被及时清除时，ROS便会对植物体造成不可逆的损伤[38-39]。SOD、POD和CAT都是抗氧化酶，当植物体内受到氧化胁迫作用时，3种酶会通过协同作用一起清除植物体内多余的ROS，减轻氧化胁迫影响[40]。本研究发现锐钛矿型、金红石型和P25混合型处理均导致浮萍SOD和POD的活性增强。这是因为TiO2-NPs刺激浮萍细胞产生了更多的ROS，SOD和POD活性受到相应刺激而升高，消除过量的O2-，防止氧化损伤。高嫄[1]的研究结果表明，在浓度为50 mg·L-1的TiO2-NPs处理时，青萍(Lemnaminor)的SOD活性显著升高，浓度为100 mg·L-1时，青萍SOD酶活性达到最大值，与本研究结果一致。王震宇等[41]的研究结果也表明，金红石型TiO2-NPs可以使植物体内ROS升高、SOD和POD活性增强。已有研究表明，当生物体受到胁迫时，SOD活性增强，而CAT活性降低[42]。本研究中锐钛矿型T50处理组导致浮萍CAT活性降低，在高嫄[1]的研究中也发现锐钛矿型TiO2-NPs在50 mg·L-1处理下青萍CAT活性下降。本研究结果表明金红石型和P25混合型处理均降低了浮萍的CAT活性。POD和CAT都是清除过氧化氢的酶，它们作为植物体内抗氧化胁迫的第二层防线，POD已经清除了过多的过氧化氢，减少了机体内过氧化氢的含量，而CAT作用于过氧化氢的机理实质上是过氧化氢的岐化，必须有2个过氧化氢分子先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上才能发生反应，所以导致了CAT活性降低。抗氧化酶的活性不稳定，并随培养时间而变化。很难证明植物是否可以通过在一定时间使用几种抗氧化酶来保护自己免受环境压力。但是，抗氧化防御酶的活性通常在有机体遇到低水平压力时增加，而在高压力条件下降低[43]。