壬基酚在SD大鼠内分泌腺、胃、心脏、肝脏、肾脏和血清的分布与消除

2021-03-25张钰婕颜婷杨警俞捷杨雪峰张建玲蒋智钢许洁

生态毒理学报 2021年6期

张钰婕，颜婷，杨警，俞捷，杨雪峰，张建玲，蒋智钢,#，许洁,*

1. 遵义医科大学公共卫生学院，遵义 563000 2. 贵州省毕节市织金县疾病预防控制中心，毕节 551700 3. 遵义医科大学附属第二医院胃肠外科，遵义 563000

壬基酚(nonylphenol, NP)是壬基酚乙氧基酸的降解物，经口暴露是NP的主要暴露途径[1]，进入人体后能模拟天然雌激素的作用，干扰正常的内分泌功能，还有致癌、致畸和致突变的作用。NP具有脂溶性，能够在脂肪组织中蓄积。它被广泛用于制造奶瓶、罐头盒子及食品包装袋等的内壁涂层和塑料制品，这些化合物具有较高的亲脂性，极易通过食品尤其是脂肪含量高的食品进行迁移，直接影响人体健康[2]。因此研究NP经消化道摄入后的分布与清除具有重要意义。目前已有关于NP清除与分布的研究，Geens等[3]研究发现，NP在人肝脏中浓度最高，其次是脑和脂肪组织。有文献表明，NP在大西洋鲑鱼体内主要排泄途径是胆汁[4]。曹向可等[5]的结果显示，雌性大鼠经消化道摄入NP后，在各组织中NP含量为卵巢>子宫>肝>肾>血清。Green等[6]研究发现，经口摄入的NP高达80%被迅速吸收，经肝脏代谢，大多数排泄物在胆汁，24 h排泄基本完成。还有研究发现，SD大鼠经消化道摄入NP后，NP主要分布于实质性器官中，经肝脏清除，食物可以减缓NP的代谢[7]。但是这些研究普遍存在灌胃剂量低、观察时间短的问题。经查阅文献和体表面积计算得到NP对大鼠灌胃的半数致死剂量(LD50)约为1 445 mg·kg-1[8]，本课题组前期对大鼠体内NP的研究表明，NP染毒剂量相对较低时也具有生物蓄积性[9]。在上述研究的基础上综合考虑，本研究加大NP染毒剂量，约取LD50的3/10 (400 mg·kg-1)作为此次实验的染毒剂量，并延长观察时间至120 h，希望能更加全面准确地了解NP在机体内的代谢特征，为进一步研究NP对机体造成的影响以及如何降低NP对机体的影响提供数据依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

液相色谱仪(Agilent公司，Agilent 1100)，色谱柱EclipseXD8-C18(150 mm×460 mm，5 μm)，电子天平(上海精科天平仪器厂，FA2204C)，数显恒温水浴锅(天津泰斯特，DK-98-Ⅱ)，离心机(上海安亭，TDL-S)，旋涡混合器(海门其林贝尔，QL-901)，手持式匀浆机(杭州雷琪实验器材有限公司，FLUKO，F10)，制冰机(雪科，IMS-30)，正己烷和乙醚(分析纯，天津科密欧)，乙腈(色谱纯，Dikma Technologies公司)，冰乙酸(色谱纯，天津科密欧)，NP标准品(Fluka)，纯净水(怡宝)，NP灌胃试剂(西亚)，玉米油(金龙鱼)。

1.2 实验动物

清洁级成年雄性SD大鼠39只，体质量180～240 g，饲养条件为室温22 ℃，随机分为13组，每组3只，自由饮水进食，适应性喂养1周，实验前12 h禁食，只给予饮水。

1.3 色谱条件

流动相为乙腈与0.1%冰乙酸(V(乙腈)∶V(0.1%冰乙酸)=85∶15)，进样量10 μL，柱温40 ℃，流速1.0 mL·min-1，FLD检测器，激发波长275 nm，发射波长312 nm。

1.4 方法与步骤

将39只大鼠随机分为13个组，每组3只。除1组作为空白对照组外，其余各组进行一次性400 mg·kg-1NP灌胃(NP溶于玉米油，灌胃体积5 mL·kg-1)，空白对照组按照同等灌胃体积对大鼠进行玉米油灌胃。灌胃后0.25、0.5、1、2、4、8、12、24、48、72、92和120 h分别腹腔注射麻醉处死大鼠并摘取其内分泌腺(甲状腺、胸腺和肾上腺)、胃、肝脏、肾脏和心脏组织及血清保存于-20 ℃冰箱待用。

精确称取NP标准品，用乙腈溶解稀释成9、45、90、450、900、1 800、3 600和12 000 ng·mL-1，分别进样10 μL，用液相色谱仪测定峰面积，以峰面积(Y)对标准浓度(X)绘制标准曲线，得出回归方程。

NP的提取：(1)分别取大鼠的内分泌腺(甲状腺、胸腺和肾上腺)、胃、肝脏、肾脏和心脏各0.5 g和血清0.5 mL。(2)将取好的组织0.5 g置于玻璃离心管内，加入正己烷-乙醚提取剂(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，用手持式匀浆机20 000 r·min-1匀浆10 s，4 000 r·min-1离心8 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至进样瓶上机检测。(3)将取好的血清0.5 mL，置于玻璃离心管内，加入正己烷-乙醚提取剂(V(正己烷)∶V(乙醚)=7∶3)4 mL，置旋涡混合器混匀30 s，静置15 min，取上清液于50 ℃水浴蒸干，加0.5 mL乙腈溶解后移至进样瓶上机检测。

1.5 数据处理

数据用药代动力学计算软件DAS 3.0进行处理。

2 结果(Results)

2.1 NP在胸腺、甲状腺和肾上腺中的浓度

以峰面积(Y)对标准浓度(X)绘制标准曲线，得出Y=16.38X-55.936，R2=0.9999，标准曲线用于后续NP在各组织的浓度测定。如图1所示，NP在胸腺中0 h的浓度高于其他腺体，c0=2.006 mg·L-1。摄入后2～4 h吸收速率增大，在第4小时达到峰浓度，cmax=4.927 mg·L-1，是初始浓度的2倍多。最低浓度为1.412 mg·L-1，120 h时浓度为1.803 mg·L-1与初始浓度相差不大。甲状腺中NP浓度在2 h达到峰值，较胸腺达峰时间早，cmax=3.580 mg·L-1，甲状腺中NP吸收速度较胸腺快。在0 h肾上腺中NP浓度最低，c0=0.183 mg·L-1。在8 h达到峰浓度，cmax=3.451 mg·L-1，达峰后浓度极速下降变为0.662 mg·L-1(12 h)。

2.2 NP在胃、心脏、肝脏和肾脏中的浓度

如图2所示，NP在胃内的初始浓度为0.35 mg·L-1，在2 h达到峰浓度且峰浓度很大，cmax=41.4 mg·L-1。在24 h浓度降为2.88 mg·L-1，在120 h浓度降为0.53 mg·L-1。呈现吸收较快，达峰时间短的趋

图1 壬基酚(NP)暴露后SD大鼠胸腺、肾上腺和甲状腺中NP含量-时间关系图Fig. 1 The content-time relationship diagram for nonylphenol (NP) in SD rat thymus, adrenal gland and thyroid after NP exposure

势。心脏、肝脏和肾脏中的NP浓度一直都较低，均在4 h达到峰浓度。cmax(心)=2.45 mg·L-1，cmax(肝)=1.41 mg·L-1，cmax(肾)=2.18 mg·L-1。在120 h胃、心脏、肝脏和肾脏内NP浓度趋近于0。

2.3 NP在血清中的浓度

如图3所示，血清中NP的初始浓度较低，c0=0.263 mg·L-1，在2 h达到峰浓度，cmax=1.931 mg·L-1。2～4 h内浓度直线下降，到4 h浓度下降为1.061 mg·L-1，之后浓度变化为平缓曲线。在120 h时浓度变为0.263 mg·L-1与初始浓度相等。

2.4 NP的代谢动力学

采用药代动力学软件DAS3.0处理数据，得出NP在内分泌腺、胃、心脏、肝脏和肾脏中的代谢动力

图2 NP暴露后SD大鼠胃、心、肝和肾脏中 NP含量-时间关系图Fig. 2 The content-time relationship diagram for NP in SD rat stomach, heart, liver, kidney after NP exposure

图3 NP暴露后SD大鼠血清中NP含量-时间关系图Fig. 3 The content-time relationship diagram for NP in SD rat serum after NP exposure

学参数。NP在各器官中的代谢模型除肝脏符合一室模型外，其余均符合二室模型。NP在大鼠除肝脏外的各组织内消除相半衰期(t1/2β)均为分布相半衰期(t1/2α)的10倍以上。除心脏外，自中央室向外周室转运速率常数(K12)均大于自外周室向中央室转运速率常数(K21)(表1和表2)。

2.4.1 NP在内分泌腺及血清中代谢动力学

NP在肾上腺组织中t1/2β=1 306 826.882 h，达峰时间(tmax)=8 h；在胸腺内的曲线下面积(AUC0～t)=251.534 mg·L-1·h最大、平均驻留时间(MRT0～t)=53.901 h最长、中央室总体清除率(CL/F)=0.522 L·kg-1·h-1最小；在甲状腺内的中央室表观分布容积(V/F)=66.867 L·kg-1最小、达峰时间为2 h、K12=0.275 h-1、K21=0.165 h-1、MRT0～t=50.705 h；与内分泌腺相比，血清中吸收相半衰期(t1/2Ka)=0.684 h、t1/2α=0.83 h、t1/2β=54.062 h、AUC0～t=68.646 mg·L-1·h、MRT0～t=41.148 h，均最小(表1)。

2.4.2 NP在实质性器官中代谢动力学

NP在胃内的AUC0～∞=364.319 mg·L-1·h最大，MRT0～t=24.822 h却是最小的；在心脏中，NP的t1/2Ka=2.013 h最长，中央室总体清除率(CL/F)=7.228 L·kg-1·h-1最高，这可能与心脏血流丰富、蓄积的NP较多以及心脏是泵血器官易将物质向外周扩散有关。在肝脏内，NP自中央室消除速率常数(K10)=0.21 h-1较大，K10越大消除越快，即NP在肝脏中消除快。NP在肾脏中的各项代谢动力学参数数值均接近于肝脏。与实质性器官相比，血清中MRT0～t=41.148 h是最长的(表2)。

3 讨论(Discussion)

NP是一种类似于雌激素的环境内分泌干扰物，污染严重且使用广泛。研究NP在各组织中的代谢特征，有助于发现NP含量与各组织相关疾病的关系。有文献称，血清NP浓度在结直肠癌组显著高于对照组[9]。据报导，与健康女童样本相比，性早熟女童样本血清中的双酚A(BPA)和4-NP含量明显偏高[10]。还有研究发现，肝脏、肾脏、脾脏、心脏和脑部疾病风险增加与NP暴露有关[11]。

本研究表明，除心脏外K12均大于K21，说明NP易于从中央室向外周室分布。赵猛等[12]研究得出K21>K12，NP主要分布在血流丰富的组织、器官，这与本研究的结论相反，有待进一步验证。NP在各组织中的消除相半衰期均较长，认为NP是一种难被清除的环境内分泌干扰物。曲线下面积在胃和胸腺内较大，说明NP在胃和胸腺吸收量较大。然而NP在胃内的平均驻留时间最短，表明NP与胃的亲和力较低。NP在肾上腺中的消除相半衰期很长，即消除速度较慢。这可能提示该物质与组织的亲和度很高，可以长期甚至终身驻留于体内，而难于在机体正常代谢情况下排出体外。肝脏和肾脏中NP的各项代谢动力学参数数值相近且NP消除较快，推测肝脏和肾脏是NP的代谢器官。有研究称，NP在肝脏内的代谢是以葡萄糖醛酸化合物的形式完成[13]。在以往的研究中发现，NP在肝脏和肾脏内含量，常常是肾脏大于肝脏[14]或肝脏大于肾脏[5]。而在本次实验中含量相近，这可能与一次性灌胃的剂量有关。实验发现，血清中的各项代谢动力学参数数值在所测组织中既不是最高也不是最低，这可能NP与血清亲和程度中等有关。总之，NP在胃内分布量大，驻留时间短；在内分泌腺内分布量大，驻留时间长。

本研究通过对39只大鼠一次性灌胃400 mg·kg-1的NP，得到NP在大鼠体内分布与清除的相关数据并总结其代谢特征。但本研究只选用了1个浓度的NP进行一次性灌胃，今后可进行不同浓度梯度的NP一次性灌胃或长期灌胃，并研究它们的分布与清除，以期更加了解NP的代谢规律。