响应面法优化新疆阿魏中阿魏酸的提取工艺及其抑制酪氨酸酶活性研究

阿迪拉·吐尔逊塔依，田永芝，何诗冰，努尔亚·艾尼外尔，范琳惠，约日耶提·萨力，塔吉古丽·阿不里克木

(新疆师范大学生命科学学院 新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室 干旱区植物逆境生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830054)

阿魏属于阿魏属(FerulaL.)，归类为伞形科(Umbelliferae)、芹亚科 (Apioideae)、前胡族(Peucedaneae)、阿魏亚族(Femlinae)。阿魏属植物大多分布于内陆干旱、荒漠地区[1]，是多年生一次结果的草本。全世界约有150 余种，主要分布在欧洲南部地中海地区以及中亚邻近地区。我国约有26种，1个变种，分布在东北、山西、西藏、云南、江苏和新疆等地区；其中，产于新疆的有20种，主要分布在伊宁、阜康、托里、塔城、乌恰等地区。不同种类的阿魏属植物生长的土壤类型有所不同，如新疆阿魏生长在灰钙土上，阜康阿魏生长在荒漠灰钙土上[2]。

阿魏属植物的主要化学活性成分包括倍半萜、香豆素和多硫化合物等[3]。阿魏具有解毒、抗炎、抗过敏、抗高血压等功效，对血液循环、神经、免疫系统都有影响[4]。早在古波斯就已将阿魏属植物作为药材[5]。国务院发布的“野生药材资源保护管理条例”中，新疆阿魏被列为二级保护重要野生药材物种[6]。阿魏酸(图1)最初发现于阿魏植物的种子和叶子中，是一种广泛存在于植物体内的酚酸，化学名为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一[7]。阿魏酸微溶于冷水，可溶于热水，易溶于乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯，稍溶于乙醚，难溶于苯，且pH 值稳定性好。阿魏酸见光易分解，具有较强的抗氧化性[5]。

图1 阿魏酸的化学结构式Fig.1 Chemical structural formula of ferulic acid

新疆阿魏中含有的阿魏酸具有抗癌、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抑菌消炎、抑制血小板聚集及广谱的抗变态反应的作用。阿魏酸安全无毒，具有良好的药理作用和生物活性，在医药、保健品、化妆品原料等方面有较高的应用价值[8]。阿魏酸在中药阿魏、升麻、当归、酸枣仁等中含量较高，是其有效成分之一[9]。植物细胞壁是阿魏酸的重要来源，阿魏酸在细胞中与木质素和纤维素发生酯化，主要通过酯键与多糖和木质素交联，利用酶法进行水解，可以断裂酯键将阿魏酸释放出来[10]。目前，从植物中提取阿魏酸的方法很多，主要有超临界流体萃取法、微波提取法、超声波提取法等[11]。与其它提取方法相比，超声波辅助法具有提取效率高、提取时间短、操作简单、能耗低等优点，具有较高的推广和使用价值[12]。

研究[13]表明，阿魏酸分子易透过皮肤，直接作用于病变部位，在充分阐释其作用机制的基础上，有望将阿魏酸开发成功效型化妆品，用于色素性皮肤病的预防或治疗[14]。阿魏酸对酪氨酸酶的抑制活性为天然安全的美白剂开发和食品保鲜技术如延缓果蔬、饮料类褐变提供了理论基础[15]。鉴于此，作者以阿魏酸提取率为指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化新疆阿魏中阿魏酸的超声波辅助酶法提取工艺，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法评价阿魏酸抑制酪氨酸酶活性，拟为阿魏酸的有效提取及其活性研究提供参考依据。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

阿魏，于2017年12月采自新疆伊犁。

阿魏酸标准品；木聚糖酶；无水乙醇；实验用水为蒸馏水。

KQ-500B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；台式低速离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；UV2800型紫外分光光度计；恒温水浴锅。

1.2 阿魏酸的提取及阿魏酸效应组分的制备

将新疆阿魏的根茎粉碎成粉后晾干。精确称取阿魏粉末2.00 g，按一定料液比加入60%乙醇溶液，置于超声功率为500 W、超声频率为 40 kHz 的超声波清洗仪中，在一定提取温度下提取一定时间；加入适量的木聚糖酶，置于50 ℃水浴锅中酶解45 min后，于100 ℃沸水浴灭酶 5 min；过滤，滤液倒入EP管中，3 000 r·min-1离心 8 min，上清液即为阿魏酸提取液。

将最佳条件下提取的阿魏酸提取液经大孔吸附树脂分离后，用乙醇梯度洗脱，得到阿魏酸效应组分，此组分中阿魏酸含量达到49.59%。

1.3 阿魏酸提取率的测定

1.3.1 检测波长的确定

以60%乙醇溶液作为空白对照，对阿魏酸标准溶液进行全波长扫描。结果发现，阿魏酸在323 nm处有最大特征吸收峰。因此，以323 nm作为检测波长。

1.3.2 标准曲线的绘制

精密称取阿魏酸标准品2.3 mg，用1 mL 60%乙醇溶液溶解，配制浓度分别为46 mg·L-1、23 mg·L-1、11.5 mg·L-1、5.75 mg·L-1、2.875 mg·L-1的阿魏酸标准溶液，测定323 nm处吸光度。以阿魏酸浓度(c)为横坐标、吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程为：A=0.0512c+0.1807，R2=0.9976。

1.3.3 阿魏酸提取率的计算

吸取0.5 mL阿魏酸提取液，用60%乙醇溶液稀释定容至25 mL，测定323 nm处吸光度，进行3次重复实验，吸光度取平均值。根据标准曲线方程计算阿魏酸浓度，按式(1)计算阿魏酸提取率。

(1)

式中：c为提取液中阿魏酸浓度，mg·L-1；V为提取液体积，L；n为稀释倍数；m为阿魏粉末质量，mg。

1.4 提取工艺优化

1.4.1 单因素实验

称取阿魏粉末2.00 g，分别考察料液比(1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，g∶mL，下同)、提取时间(10 min、20 min、30 min、40 min)、提取温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)、酶加量(0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)对阿魏酸提取率的影响，每组实验重复3次，取平均值。

1.4.2 响应面实验

在单因素实验的基础上，设计4因素3水平的响应面实验，因素与水平见表1。

表1 响应面实验的因素与水平

1.5 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效应组分对酪氨酸酶的抑制活性

采用酪氨酸酶多巴速率氧化法测定阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。在96孔培养板中进行反应，总反应体系200 μL：2.5 mmol·L-1DL-Dopa[左旋多巴(DL-β-3，4-Dopa)]40 μL；25 U·mL-1酪氨酸酶40 μL；测试药物40 μL；67.0 mmol·L-1PBS缓冲液80 μL。调零孔仅加67.0 mmol·L-1PBS缓冲液200 μL。将96孔培养板置于37 ℃水浴箱中孵育20 min，采用酶联免疫检测仪测定每孔溶液在490 nm处吸光度(A490)，每组实验重复测试8次。按式(2)计算酪氨酸酶活性。

(2)

式中：A为加酶不加药反应体系的A490值；A1为未加酶及药反应体系的A490值；A2为同时加入酶及药反应体系的A490值；A3为只加药不加酶反应体系的A490值。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对阿魏酸提取率的影响

在提取温度为 50 ℃、提取时间为 20 min、酶加量为 1.0%的条件下，考察料液比对阿魏酸提取率的影响，结果如图2所示。

图2 料液比对阿魏酸提取率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ferulic acid

从图2可知，随着料液比的减小，即提取溶剂用量的增加，阿魏酸提取率逐渐升高，当料液比为1∶12时，提取率达到最高；随后提取率稍微下降。因此，料液比选择1∶12较为适宜。

2.1.2 提取时间对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶10、提取温度为50 ℃、酶加量为1.0%的条件下，考察提取时间对阿魏酸提取率的影响，结果如图3所示。

图3 提取时间对阿魏酸提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on extraction rate of ferulic acid

从图3可知，当提取时间由10 min延长至20 min时，阿魏酸提取率快速升高；但继续延长提取时间，阿魏酸提取率反而下降。这可能是由于，提取时间过长会破坏阿魏酸的内部结构，导致提取率下降。因此，提取时间选择20 min较为适宜。

2.1.3 提取温度对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶12、提取时间为20 min、酶加量为1.0%的条件下，考察提取温度对阿魏酸提取率的影响，结果如图4所示。

图4 提取温度对阿魏酸提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction rate of ferulic acid

从图4可知，随着提取温度的升高，阿魏酸提取率先升高后降低；当提取温度为 50 ℃时，提取率达到最高。这可能是因为，提取温度过高，阿魏酸结构可能被破坏或者使植物组织软化。因此，提取温度选择50 ℃较为适宜。

2.1.4 酶加量对阿魏酸提取率的影响

在料液比为1∶10、提取时间为20 min、提取温度为50 ℃的条件下，考察酶加量对阿魏酸提取率的影响，结果如图5所示。

图5 酶加量对阿魏酸提取率的影响Fig.5 Effect of enzyme dosage on extraction rate of ferulic acid

从图5可知，当酶加量由 0.8%增至1.2%时，阿魏酸提取率逐渐升高；继续增大酶加量，阿魏酸提取率明显下降。因此，酶加量选择1.2%较为适宜。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 响应面实验设计及结果(表2)

利用Minita18软件对表2数据进行多元回归拟合，得到二次回归方程：Y=1.9918+0.0016A+0.1455B-0.0617C+0.1353D+0.0398A2-0.2296B2+0.0133C2-0.3730D2-0.0181AB-0.0176AC-0.0050AD-0.0818BC+0.2103BD+0.0328CD。

表2 响应面实验设计及结果

对响应面模型进行统计学处理，方差分析结果如表3所示，标准化效应如图6所示。

从表3、图6可知，模型P=0.010，所建模型极显著。因此，该模型的拟合程度良好，回归方程具有统计学意义，可以利用该模型对阿魏酸提取率进行分析。对模型中回归方程的各项系数进行显著性检验，可知一次项B、D及交互项BD影响显著，二次项B2、D2

表3 响应面模型的方差分析

图6 标准化效应图Fig.6 Diagram of standardized effect

影响极显著。表明，料液比和提取温度对阿魏酸提取率有显著影响，各因素对阿魏酸提取率的影响大小依次为：料液比(B)>提取温度(D)>提取时间(C)>酶加量(A)。

2.2.2 响应面分析

提取温度与料液比、酶加量、提取时间的交互作用对阿魏酸提取率影响的响应面图和等高线图如图7所示，多响应预测结果如表4所示。

从图7可知，料液比对阿魏酸提取率的影响最为显著，表现为曲线较陡。料液比和提取温度的交互影响较为显著，与方差分析的结果一致。从表4可知，新疆阿魏中阿魏酸的预测最佳提取工艺条件为：酶加量1.4%、料液比1∶13.19、提取时间10 min、提取温度50.3 ℃，在此条件下，阿魏酸提取率为2.202%。

表4 多响应预测结果

2.3 阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效应组分对酪氨酸酶活性的抑制作用(图8)

从图8可知，阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效应组分均对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性的特点，进一步表明阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效应组分均可以通过抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素的合成。

3 结论

以阿魏酸提取率为指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化新疆阿魏中阿魏酸的超声波辅助酶法提取工艺，并采用酪氨酸酶多巴速率氧化法评价阿魏酸抑制酪氨酸酶活性。结果表明，新疆阿魏中阿魏酸的最佳提取工艺条件为：酶加量1.4%、料液比1∶13.19(g∶mL)、提取时间10 min、提取温度50.3 ℃，在此条件下，阿魏酸提取率为2.202%。阿魏酸及新疆阿魏中阿魏酸效应组分均对酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用，并呈浓度依赖性的特点。可对阿魏酸进行结构改造和修饰，以开发出活性更强、毒副作用更小的阿魏酸类衍生物。

图8 阿魏酸(a)及新疆阿魏中阿魏酸效应组分(b)对酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibition of tyrosinase activity of ferulic acid and effective components of ferulic acid from Ferula sinkiangensis K.M.Shen.