褪黑素对抑郁大鼠行为学及单胺类神经递质影响

曾龙平 陈昊然 葛成璞 庞圆君 林山仪

【摘要】 目的：探究褪黑素（MT）對慢性不可预见温和应激模型（CUMS）抑郁大鼠的行为学及海马内单胺类神经递质影响。方法：选取60只健康雄性SD大鼠随机分为空白组（0.9%氯化钠溶液）、模型组（0.9%氯化钠溶液）、氟西汀阳性对照组（氟西汀2.1 mg/kg）、MT低剂量组（MT 10 mg/kg）、MT中剂量组（MT 20 mg/kg）、MT高剂量组（MT 40 mg/kg），每组10只，腹腔注射给药，连续6周。除空白组外，其余各组均在给药同时配合CMUS法复制抑郁模型。在第0、14、28、42 d通过大鼠体重变化、糖水偏好实验（SPT）、旷场实验（OFT）和强迫游泳实验（FST）测试大鼠的抑郁行为改变，并通过ELISA法检测各组大鼠海马多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）的含量测定其脑内单胺类神经递质含量。结果：模型组第14、28、42天的体重均低于空白组（P<0.05）。与空白组相比，第28、42天模型组的糖水偏好率、后4 min内运动总路径、中央运动路径、后4 min挣扎时间比均降低（P<0.05）。与模型组相比，氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组第28、42天体重、糖水偏好率、后4 min内运动总路径、中央区运动域路径、后4 min挣扎时间比均升高（P<0.05）。第42天MT高剂量组体重、糖水偏好率、后4 min内运动总路径、中央区运动域路径、后4 min挣扎时间比均高于MT中、低剂量组（P<0.05）。与空白组相比，模型组海马DA、NE、5-HT含量均下降（P<0.05）;与模型组相比，氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组的DA、NE、5-HT含量均升高（P<0.05）。MT高剂量组的DA、NE、5-HT含量均高于MT中、低剂量组（P<0.05）。结论：MT具有改善抑郁大鼠行为学的作用，作用机制可能与其影响脑内单胺类神经递质的含量有关，且MT改善抑郁作用可能存在的剂量效应关系。

【关键词】 褪黑素 抑郁症 行为学 单胺类神经递质

Influence of Melatonin on Praxeology and Monoamine Neurotransmitters of Depressed Rats/ZENG Longping， CHEN Haoran， GE Chengpu， PANG Yuanjun， LIN Shanyi. //Medical Innovation of China， 2021， 18（34）： 0-043

[Abstract] Objective： To explore the influence of melatonin （MT） on the behavior and monoamine neurotransmitters in depressed rats under hippocampus of chronic unpredictable mild stress model （CUMS）. Method： Sixty healthy male SD rats were randomly divided into blank group （0.9% sodium chloride solution）， model group （0.9% Sodium Chloride Solution）， Fluoxetine positive control group （2.1 mg/kg）， MT low dose group （MT 10 mg/kg）， MT medium dose group （MT 20 mg/kg） and MT high dose group （MT 40 mg/kg）， 10 in each group， intraperitoneal injection for 6 weeks. Except blank group， depression model was replicated in other groups with CMUS method at the same time. At 0， 14， 28 and 42 days， the changes of body weight， sugar water preference test （SPT）， open field test （OFT） and forced swimming test （FST） were used to test the changes of depressive behavior in rats. The contents of dopamine （DA）， norepinephrine （NE） and 5-hydroxytryptamine （5-HT） in hippocampus were determined by ELISA. Result： The body weight on day 14， 28 and 42 of model group were lower than those of blank group （P<0.05）. Compared with blank group， sugar water preference rate， total exercise path in the last 4 min， central exercise path and struggle time ratio in the last 4 min in model group were all decreased on day 28 and 42 （P<0.05）. Compared with model group， the body weight， sugar water preference rate， total movement path in the last 4 min， central movement area path and struggle time in the last 4 min in Fluoxetine positive control group， low， medium and high dose MT groups were increased on day 28 and 42 （P<0.05）. On day 42， the body weight， sugar water preference rate， total movement path in the last 4 min， movement area path in the central region and struggle time ratio in the last 4 min in the MT high dose group were higher than those in the MT medium dose and low dose groups （P<0.05）. Compared with blank group， the contents of DA， NE and 5-HT in hippocampus of model group were decreased （P<0.05）. Compared with model group， the contents of DA， NE and 5-HT in fluoxetine positive control group， MT low， medium and high dose groups were increased （P<0.05）. The contents of DA， NE and 5-HT in MT high dose group were higher than those in MT medium dose and low dose groups （P<0.05）. Conclusion： MT can improve the behavior of depressed rats， and the mechanism of which may has a close correlation with its effect on the content of monoamine neurotransmitters in the brain. There may be a dose effect relationship between MT and depression.

[Key words] Melatonin Depression Praxeology Monoamine neurotransmitters

First-author’s address： Qiqihar Medical University Mental Health Department， Qiqihar 161006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.34.009

抑郁症是一种严重情绪节律障碍性精神疾病，以显著而持久的心境低落为主要临床症状，其病因复杂，在生化因素可能与5-HT、DA、NE等神经递质的浓度水平或功能下降有关[1]。现今使用的抗抑郁药物主要通过调节单胺类神经递质及受体功能来改善抑郁，虽疗效明确，但其具有抗抑郁谱窄、不良反应较多等缺点[2]。褪黑素（MT）是由脑松果体合成分泌的一种吲哚类神经内分泌激素，具有调节机体昼夜节律、抗氧化、抗炎等功效[3]。近年来有研究表明MT与抑郁症、精神分裂、帕金森病等神经精神类疾病存在关联[4]。本课题组通过探究不同剂量褪黑素对CUMS模型抑郁大鼠的行为学影响，测定大鼠海马内5-HT、DA、NE的含量，初步探究MT的抗抑郁作用，讨论其作用机制及剂量效应关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 SPF级成年雄性大鼠60只，体重180～220 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供，动物许可证号：SCXK（辽）2020-0001。购入后饲养于齐齐哈尔医学院实验动物中心，室温为（22±1）℃、相对湿度为65%～70%、光照周期为12 h/12 h。饲养期间大鼠自由饮水和摄食，适应性饲养7 d。

1.1.2 药物与试剂 褪黑素（生产厂家：北京索莱宝科技有限公司，规格：5 g，纯度：99.8%）;盐酸氟西汀胶囊（生产厂家：礼来苏州制药有限公司，批准文号：国药准字J20170022，规格：20 mg/粒）;PBS缓冲液由齐齐哈尔医学院机能实验室配置;多巴胺ELISA检测试剂盒（批号：20200929）、5羟色胺ELISA检测试剂盒（批号：20200929）、去甲肾上腺素ELISA检测试剂盒（批号：20200929），均由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.3 主要仪器 大鼠行为观察敞箱、强迫游泳实验装置（上海欣软信息有限公司）;BIO-RAD 680全自动酶标仪（美国BIO-RAD公司）;CPA3245分析天平（德国赛多利斯公司）;3-30K微量高速离心机（德国sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与给药方法 经过7 d适应性饲养后将大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀阳性对照组和MT低、中、高剂量组，每组10只。空白组大鼠按照群居饲养，其余各组大鼠均单笼孤养[5]。各组药物用0.9%氯化钠溶液配置到所需质量浓度：氟西汀阳性对照组2.1 mg/kg（按人临床等效剂量，以体表面积换算得到）;MT低、中、高剂量组分别为10.0、20.0、40.0 mg/kg[6];空白对照组与模型组大鼠则给予等量0.9%氯化钠溶液。各组腹腔注射给药，给药体积为10 mL/kg。每天给药1次，连续给药42 d。

1.2.2 CUMS模型的建立 除空白组外，各组大鼠在给药1 h内采用不可预见温和应激（CUMS）法造模。造模具体方法包括：禁食（24 h）、禁水（24 h）、冰水浴（4℃、6 min）、热刺激（40℃、10 min）、束缚（3 h）、夹尾（2 min）、潮湿垫料（24 h）、超声（60 W、3 h）、昼夜颠倒、24 h光照[7]。根据随机数字表，连续刺激42 d。每天给予1种应激，且每种应激不得连续出现2次。

1.2.3 体重测定 在实验开始第0、14、28、42天，分别测定每只大鼠的体重改变。

1.2.4 糖水偏好率测定 在实验开始第0、14、28、42天测定各组大鼠糖水偏好率。先放置两瓶1%的蔗糖水溶液，24 h之后将其中一瓶换成纯水，12 h后调换两个水瓶位置，再饲养12 h完成糖水适应期。将各组大鼠禁食禁水12 h后，在鼠笼上分别放上1%的蔗糖水溶液与纯水，禁食12 h，拿走瓶子，记录两个瓶子的液体消耗[8]。计算糖水偏好率=糖水消耗量/（糖水消耗量+纯水消耗量）×100%。

1.2.5 旷场实验 在实验開始第0、7、14、28、42天，糖水消耗实验结束2 h后进行旷场实验。实验在安静漆黑的房间内进行。将大鼠置于大鼠行为观察敞箱中央，由摄像机观察并记录大鼠在6 min内的活动状况，使用动物行为学分析软件记录后4 min内大鼠的运动总路程和中央运动路程[9]。每只大鼠测试完成后彻底清洁实验箱，再进行下一只大鼠的实验，以免粪便气味等因素对实验结果的影响。

1.2.6 强迫游泳实验 在旷场实验结束的次日，进行强迫游泳实验。将各组大鼠依此放入强迫游泳装置，水温控制在25 ℃左右，使大鼠强迫游泳6 min，使用动物行为学分析软件记录大鼠在后4 min内的挣扎状态时间和不动漂浮状态时间，计算每只大鼠的挣扎时间比[10]。每只大鼠进行实验后应更换强迫游泳装置内的水，避免粪便气味等对实验结果的影响。挣扎时间比=后4 min挣扎时间/4 min。

1.2.7 测定海马内单胺类神经递质 在实验第42天结束行为学实验后，将小鼠断头处死，迅速在冰上剥离大脑海马，置于组织冷冻管中用液氮快速冷冻，放入-80 ℃冰箱保存。测定递质前将海马解冻，加入9倍体积的PBS匀浆，使用超声组织匀浆器制成10%组织匀浆液，将匀浆液置入离心管中，于4 ℃条件下以3 000 r/min速度离心20 min，静置后仔细收集上清液，按照ELISA试剂盒说明书步骤分别测定各组大鼠海马中DA、5-HT、NE的含量。

1.4 统计学处理 采用SPSS 25.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况与体重比较 第14天可观察到模型组与空白组相比大鼠毛发枯黄、活动明显减少、精神萎靡，消耗的饲料量下降，出现自残行为，撕咬自身背部皮肤导致受伤，以上症状随着时间逐渐加重。模型组第14、28、42天的体重均低于空白组（P<0.05）。与模型组相比，氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组大鼠一般情况较好，在笼内活动度高，未有自残行为，第28、42天体重均增加，差异均有统计学意义（P<0.05）。第42天MT高剂量组体重高于MT中、低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组糖水偏好率比较 与空白组相比，第28、42天模型组的糖水偏好率均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）;第28、42天，与模型组相比，氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组的糖水偏好率均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。第42天MT高剂量组糖水偏好率高于MT中、低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3 各组旷场实验结果比较 与空白组相比，第28、42天模型组后4 min内运动总路径、中央运动路径均减少（P<0.05）。与模型组相比，第28、42天氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组的后4 min内运动总路径、中央区运动域路径均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。第42天MT高剂量组的后4 min内运动总路径、中央运动路径均高于MT低、中剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表3、4。

2.4 各组强迫游泳实验结果比较 与空白组对比，第28、42天模型组的后4 min挣扎时间比均降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。与模型组相比，第28、42天氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组的后4 min挣扎时间比均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。第42天MT高剂量组的挣扎时间比均较MT低、中剂量组升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表5。

2.5 各组海马DA、NE、5-HT含量比较 與空白组相比，模型组海马DA、NE、5-HT含量均下降，差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，氟西汀阳性对照组、MT低、中、高剂量组的DA、NE、5-HT含量均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。MT高剂量组的DA、NE、5-HT含量均高于MT中、低剂量组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表6。

3 讨论

单胺假说在抑郁症的发病机制中已得到较为广泛的认可，其认为中枢神经系统突触间隙多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）等单胺类神经递质浓度水平或功能下降是抑郁症的生物学基础，进而认为通过改善突触间隙神经递质的水平能达到治疗抑郁症的效果[11]。目前临床使用的许多抗抑郁药物亦是基于此假说研发的，但多为单一靶点药物，本课题组试探究褪黑素（MT）这一作用靶点多、效果温和而不良反应小的药物对与大鼠的抗抑郁作用及其机制，并初步研究其剂量效应关系。

现有研究已证明MT与抑郁症之间关系密切，抑郁症患者症状发作期间，脑内MT含量下降，缓解后再度上升，使用MT或MT受体激动剂可能具有抗抑郁效果[12]。有学者从PKC-IP3信号通路方面，探究褪黑素对大鼠海马组织氧化应激的保护作用与行为学改变[13];另有研究从褪黑素对清醒睡眠状态的转化、特异性诱导睡眠作用上入手，探究其改善大鼠睡眠障碍的作用[14];还有学者通过测定褪黑素对大鼠脑内Aβ、Caspase-3、nNOS、Ca2+含量改变，探究其对脑组织的保护作用[15]。

已有的研究证明MT与脑内DA、NE、5-HT的联系密切：目前已检测到MT1受体在海马多巴胺能系统的表达[16]，由于MT具有抗氧化的功能，可能起到抑制单胺能神经细胞的死亡，保护海马区单胺神经元的作用，从而提高其突触间隙含量[17-19];MT具有抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的作用[20-21]，而HPA轴与体内单胺能系统关系密切，皮质醇的增多会抑制单胺类神经递质的含量，因此MT可能通过抑制HPA轴起到提升中枢神经系统内的DA、NE、5-HT作用;研究已表明，褪黑素能调节海马神经细胞的昼夜节律问题，使昼夜皮质醇水平恢复节律[22]，其作用机制可能与HPA轴节律的恢复有关[23]。但目前较少有研究讨论MT的抗抑郁作用是否与改善神经系统突触间隙单胺类神经递质存在关联。

本研究采用慢性不可预见温和应激（CUMS）抑郁模型模拟人在社会环境中所可能遭遇的应激情况，与临床抑郁表现相似，符合发病机制[24]。由于目前研究褪黑素对大鼠抗抑郁的实验中较少有大剂量的使用（>20 mg/kg），因此在经过前期预实验后（注射不同剂量褪黑素后观察大鼠的行为学以及有无不良反应），本课题组使用10、20、40 mg/kg作为浓度梯度，探究较高浓度褪黑素的抗抑郁效果。为探究褪黑素用作抗抑郁药，在临床使用的可能性，本研究改进了常规的CMUS观察法，选择在造模的同步进行给药，延长观察时间，并且每7 d进行一次行为学测定，观察在使用MT的整个过程中大鼠的行为改变。通过测定糖水偏好、旷场实验、强迫游泳实验，从快感缺失、自发活动、绝望状态三个维度评价大鼠的抑郁状态[25]。研究发现MT从28 d时已出现显著的改善抑郁效果，且整体作用平稳，未出现反跳现象。并且在10～40 mg/kg的浓度范围内，MT对大鼠的抗抑郁作用随浓度增加而加强，未出现不良反应，提示MT的抗抑郁效果可能存在剂量效应关系。通过对比各组实验大鼠海马内的DA、NE、5-HT的含量可知：褪黑素具有改善抑郁大鼠海马内单胺类神经递质的作用，在各实验组中以MT高剂量组的提升作用最大，提示其可能的剂量效应关系。

由于MT靶点的广泛以及代谢途径众多，目前抗抑郁作用机制尚未不十分明确。课题组认为MT抗抑郁效果的多种作用途径，其最终结果可能与通过改善突触间隙神经递质的水平有关，本实验通过探究MT的抗抑郁效果，证实其与提升海马内单胺类神经递质之间的相关性，希望为下一步研究褪黑素抗抑郁作用的分子机制与信号通路提供新思路。

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（收稿日期：2021-09-07）

基金项目：国家级大学生创新创业项目（202011230006）

①齐齐哈尔医学院精神卫生学院 黑龙江 齐齐哈尔 161006

通信作者：曾龙平