第2代DNA测序技术在肝癌研究中的应用进展

焦 扬,吴 帆，2

(1.贵州医科大学， 贵州 贵阳 550025；2.广州市红十字会医院肝胆外科， 广东 广州 510220)

肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居我国各类癌症发病率的第4位，病死率居第2位[1]，对我国人民的生命健康造成了严重的威胁。因此，使用更快捷、简便的检测方法筛选出有效的肝癌诊断标志物及治疗靶点以指导肝癌的精准治疗是目前一项迫切的任务。DNA测序技术的出现为肝癌的诊治带来了新的途径，尤其是第2代DNA测序技术因其通量大、灵敏度高、检测速度快、成本低等优点，成为了近年来极具吸引力的测序技术之一，已经在肝癌研究中得以应用并取得了巨大的进步。本文综述了第2代DNA测序技术的发展及其在肝癌的基因突变、信号传导通路等方面的应用。

1 第1代DNA测序技术

DNA测序技术是指分析特定DNA片段的碱基序列(即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的排列方式)的实验技术。DNA测序技术的出现极大地推动了生物学和医学的研究与发展，使得人类对基因的研究逐渐深入[2]。第1代DNA测序技术是SANGER等[3]于19世纪70年代在基因研究中发现的创新性技术，也被称为“桑格测序技术”，该技术的原理是核苷酸在某一固定的碱基处开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤结束的4组不同长度的核苷酸，然后在尿素变性的丙烯酰胺凝胶上电泳，从而获得可见的DNA碱基序列。应用桑格测序技术，人们首次完成了人类基因组的测序，但由于该技术是通过短链DNA片段的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增实现的测序，因而成本高、工作量大，且只能对特定的样本(如DNA片段)进行测序，这也决定了该技术无法直接应用于癌症患者的临床诊断和治疗。

2 第2代DNA测序技术

自桑格测序技术创建以来，尽管其仍然存在成本高且耗时长的固有缺点，但一直被作为分子生物学研究的金标准[4]。但随着人们对基因研究的不断深入以及科学技术的不断革新，逐渐出现了第2代DNA测序技术。

2.1 第2代DNA测序技术的优点近10 a来，第2代DNA测序技术逐渐成形，具有高通量、高灵敏度、低成本、耗时短等优点[5]，其逐渐取代桑格测序技术成为目前基因研究中最常使用的方法之一。第1代DNA测序技术需要耗费数十亿美元和数年时间才能完成人类基因组测序，第2代DNA测序技术则仅需耗费几千美元并在短短几天内就能完成1个人的基因组测序，这为癌症患者的及时诊治带来了曙光[6]。第2代DNA测序技术的成功在于其不需要提前了解序列，就可以同时对数百万的基因片段进行大规模的测序，因此,使其耗费的成本和时间都显著降低[7-8]。

在基础研究方面，第2代DNA测序技术已经广泛应用于全基因组测序、全外显子组测序、转录组测序、靶向区域测序、表观遗传测序等，使得基因相关的基础研究得到了快速的发展，研究数据的分析也更加精确、可靠[9-11]。在临床治疗方面，第2代DNA测序技术可以用于各种疾病尤其是癌症的分子诊断及预后评估，有助于癌症的个性化治疗和精准医疗。第2代DNA测序技术已经可以识别多种癌症的突变基因，包括肝癌、膀胱癌、乳腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌、前列腺癌、急性粒细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病等，使精确、高效地识别癌症的罕见特异性基因突变成为可能。正是第2代DNA测序技术的应用和普及，才使癌症基因组图谱和国际癌症基因组联盟等大型研究项目得以进一步完善，从而为研究癌症的类型及分类提供更加准确的数据支持。

2.2 第2代DNA测序技术的方法目前，已经有多家公司研发了各具特点的第2代DNA测序技术。Roche公司推出的测序技术是以焦磷酸测序法为基础，依靠生物发光法对DNA序列进行检测，在进行未知基因组测序方面具有较大优势，但在处理碱基序列时会因荧光信号的判断错误导致核苷酸插入或缺失[12]。Illumina-Solexa公司利用其专利核心技术“DNA簇”和“可逆性末端终结”，实现自动化样本制备及基因组中数百万个碱基的大规模平行测序[13]。Ion Torrent公司推出了第1个不需要光学系统的测序仪，其所采用的技术为半导体测序，将化学信号通过半导体芯片直接转换为数字信号，是适合扩增子测序的革命性技术[14]。SOLID公司使用连接法测序技术获得基于“双碱基编码原理”的颜色编码序列，对原始颜色序列进行数据分析后转换成颜色编码的标准序列，把颜色序列定位到标准序列上，同时校正测序错误，结合原始颜色序列的质量信息发现潜在单核苷酸多态性位点[15]。QIGEN公司推出的Gene Reader系统包含了从最初的数据收集到最终的数据分析，建立了一个标准的第2代DNA测序技术工作流程，可以靶向DNA检测并得到明确的临床结果[16]。

第2代DNA测序技术除了上述几种测序技术外，还有美国太平洋生物科学公司、英国牛津纳米孔技术有限公司、Bionano Genomics公司等的测序技术[17-19]，这些测序技术在不同的方面展现出了各自的优势，是测序技术的一次重要改革，增加了测序的通量，缩短了时间，降低了成本。第2代DNA测序技术比桑格测序技术的涵盖面更加宽广，同时可以实现临床实验室要求的特异性、敏感性、重现性和分析准确性。

2.3 第2代DNA测序技术的基本步骤无论使用何种平台进行第2代DNA测序技术测序，都需要以下步骤[20]：(1)临床病理诊断、提取样本DNA/RNA；(2)选择第2代DNA测序技术测序类型，包括全基因组测序、全外显子组测序、靶向测序等；(3)基因文库生成，指选择DNA片段并通过适配器放大和浓缩样品；(4)依赖平台生成模版；(5)进行数据分析、序列质量评价、比对参考序列、变异调用、变异注释、致病变异的识别、解释和分类。

3 第2代DNA测序技术在肝癌研究中的应用

3.1 第2代DNA测序技术在肝癌基因突变研究中的应用第2代DNA测序技术的出现及应用，使对肝癌基因突变的研究取得了巨大的突破。使用第二代DNA测序技术检测肝癌基因突变是通过分别提取正常肝脏组织、肝癌癌旁组织、肝癌原发灶组织、肝癌转移灶组织及肝癌异体移植组织等的DNA进行基因组测序，使用Newbler、AMOScmp、Phred/Phrap/Consed/Polyphred和Velvet等软件进行基因组组装后与基因组平均读取覆盖度进行比较，过滤掉低质量的测序数据，将高质量的测序数据与参考基因组或数据库进行比对，筛选出单碱基变异、插入缺失、拷贝数变异、结构变异等，然后可利用Glimmer、GeneMarkS、Prodiga等蛋白质编码基因预测软件进行基因预测，再利用特定的软件或数据库进行基因组注释得到基因组序列，分析预测其对蛋白质功能的影响。

KAN等[21]通过第2代DNA测序技术对88例肝癌患者进行基因组测序分析，不仅验证了众多已经发现的基因突变位点，同时还发现了BRCA2基因和IGF1R基因新突变位点，从而为肝癌发生机制的研究提供了新的思路。此外，LU等[22]通过第2代DNA测序技术研究p53基因突变在人肝癌细胞中的作用，也发现了一些既往认为与肝癌无关的癌基因的突变，包括RUNX1基因和 JAK3 基因，这对于肝癌基因图谱的完善有很大的帮助。OBA等[23]利用第2代DNA测序技术开展的研究也表明，ARID2基因的缺失减弱了DNA损伤部位的核苷酸切除修复，提示ARID2基因可能参与DNA的修复。ARID2基因在肝炎相关肝癌组织中表达下调，其也被认为是肝炎相关肝癌细胞中基因突变的抑制因子，因而有望利用ARID2基因诱导肝癌细胞凋亡，从而对肝炎相关肝癌患者的治疗带来新的突破[23]。YIN等[24]通过第2代DNA测序技术对肝癌患者的体细胞线粒体DNA突变进行分析，发现肝癌组织中D-环区突变的异质性水平显著升高，提示肝癌组织中D-环区突变可能是阳性选择；同时也发现D-环区突变患者的线粒体DNA拷贝数明显较低，癌症复发的可能性更大；体外实验进一步表明，D-环区突变的肝癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显高于无D-环区突变的肝癌细胞。

3.2 第2代DNA测序技术在肝癌信号传导通路研究中的应用通过第2代DNA测序技术对基因序列进行高通量筛选，并结合相应的细胞功能实验，不仅可以验证和发现基因突变位点，而且还可以为基因的信号传导通路研究提供方向。近年来已发现TERT启动子、CTNNB1、AXIN1、LAMA2、ARID1A、WWP1等众多基因在肝癌发生发展的过程中具有显著的调控作用[25-30]。此外，第2代DNA测序技术同样可以应用于非编码RNA的信号通路研究中。ZHUANG等[31]报道了一种新的长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)-DRHC，lncRNA-DRHC 在肝癌细胞中呈低表达，且其低表达与肝癌患者的不良预后相关，在体外实验中也发现其可以抑制肝癌细胞系的增殖、迁移、侵袭和上皮-间充质转化；基于第2代DNA测序技术发现 lncRNA-DRHC与MYBBP1A基因存在相互作用，并且lncRNA-DRHC可通过转录因子c-Myb调节有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中的MEK/ERK信号通路，表明lncRNA-DRHC在肝癌的进展中起着关键作用，其有望成为一个新的肝癌治疗靶点。ZHANG等[32]采用第2代DNA测序技术对肝癌患者肿瘤相关成纤维细胞和癌旁成纤维细胞的外显子进行测序发现，肝癌患者肿瘤相关成纤维细胞提取液中外泌体内的微RNA (microRNA,miR)-320a水平显著降低，进一步研究发现，miR-320a可以通过与其下游靶点PBX3基因结合来抑制MAPK通路的激活，从而抑制肿瘤的进展，发挥抗肿瘤作用，因此，miR-320a可能是抑制肝癌进展的潜在治疗靶点。CHAVALIT等[33]采用第二代DNA测序技术对聚乙二醇-干扰素α-2a治疗后的慢性肝炎患者血清中的乙肝病毒编码的miR-3(hepatitis B virus encoded microRNA-3，HBV-miR-3)进行分析，证实HBV-miR-3可通过抑制镁离子依赖的蛋白磷酸酶1A的表达促进肝癌相关细胞的增殖，这是首次在肝癌的研究中发现乙肝病毒编码的miRNA可以调节宿主基因的表达。

3.3 第2代DNA测序技术在肝癌其他方面研究中的应用第2代DNA测序技术还可以用于筛选肝癌诊断和预后判断的分子标志物。徐红梅等[34]利用转录组测序技术获取4例肝癌患者和3例健康对照者外周血单个核细胞中环状RNA的差异表达谱，采用GO/KEGG富集分析差异表达显著的环状RNA及其潜在功能和信号通路，并对其中6种显著差异的环状RNA通过实时荧光定量PCR在72例肝癌患者和30例健康对照者外周血单核细胞样本中再次进行验证，最后结合受试者工作特征曲线发现circ0000798最有潜力成为肝癌无创性诊断分子标志物。CHEN等[35]通过使用转录组测序技术发现，HK2基因和ENO1基因在肝癌组织中的表达明显高于正常组织，并且HK2基因和ENO1基因在p53突变型肝癌组织中的表达也明显高于p53野生型肝癌组织，提示HK2基因和ENO1基因与突变型p53肝癌的发生有关；同时根据HK2基因和ENO1基因在热图中是红色像素，采用Kaplan-meier方法对这2种基因进行总体生存曲线分析，显示其在预后较差的肝癌患者中呈高表达，提示HK2基因和ENO1基因是潜在的肝癌预后标志物，同时验证了利用世界范围内丰富的转录组测序技术数据来识别肝癌新的潜在标志物具有很好的效果。此外，第2代DNA测序技术也有助于肝癌治疗药物的研发。王惠国等[36]通过对HepG2和Huh7肝癌细胞给予不同浓度的青蒿素，培养不同时间，再利用第2代DNA测序技术对2种肝癌细胞系中的miRNA进行测序分析，并结合细胞活力实验和细胞克隆实验证实，青蒿素可抑制HepG2和Huh7肝癌细胞系的增殖，且青蒿素的这种效应具有剂量依赖性和时间依赖性。此外，王惠国等[35]还通过靶基因富集分析第2代DNA测序技术得到的数据发现，青蒿素是通过调控Rap1和MAPK信号通路抑制HepG2和Huh7肝癌细胞系的增殖，这为青蒿素在肝癌治疗中的应用提供了新的实验依据。

4 总结与展望

第2代DNA测序技术的广泛应用对于肝癌研究发挥了显著的促进作用，为肝癌精准医疗、个性化治疗等医疗理念的实现提供了有力的支撑，并可为寻找新的肝癌治疗靶点和诊断标志物提供重要的实验依据。近几年来，成本更低、测序速度更快、PCR偏倚更小的第3、4代测序技术正在逐渐出现，但第3、4代测序技术目前仍处于发展测试阶段，技术还不够成熟，尚不能为肝癌研究带来质的改变，相信随着技术的改进和完善其在未来也将成为肝癌研究的重要方法。