丁苯酞对糖尿病合并阿尔茨海默病大鼠记忆能力的影响

孙治坤,马兴荣,陈 帅,贺 爽,张杰文

(1.河南省人民医院神经内科，河南 郑州 450003;2.郑州大学第一附属医院神经内科，河南 郑州 450052)

随着我国人口老龄化的不断加剧，老年相关性疾病如糖尿病(diabetes mellitus，DM)和阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)已成为严重影响人们生活质量的重要疾病。研究证实，DM患者发生AD的相对性风险是非DM患者的2倍[1-3]。丁苯酞具有多种神经保护功能，对脑梗死、帕金森病、血管性认知功能障碍、AD等均具有保护作用[4-7]。但目前关于丁苯酞治疗DM合并AD的研究甚少，基于此，本研究制备了DM合并AD大鼠模型，并给予丁苯酞进行干预，以探讨丁苯酞对DM合并AD的治疗作用，为临床DM合并AD的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物健康8～10月龄Wistar大鼠32只，雌雄不拘，体质量250～300 g，由河南省实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ1-40)和链脲佐菌素购自美国Sigma公司，丁苯酞购自石家庄石药集团恩必普药业有限公司(国药准字H20050299)，实验室专用玉米油购自美国Acros Organics公司，双辛可宁酸(bicinchonininc acid，BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase，AchE)试剂盒、胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)试剂盒及谷胱甘肽(glutathione，GSH)试剂盒购自中国南京建成生物公司，白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)及白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)试剂盒购自美国Sigma公司；Morris水迷宫购自上海中国科学院分院，低温台式离心机购自德国Heraeus公司，多功能酶标仪购自瑞典Tecan 公司，BS200S型电子天平购自德国Sartorius公司，721型光栅分光光度计购自上海分析仪器总厂。

1.3 实验分组及各组干预措施常规饲养3 d，相对灵活的大鼠32只随机分为空白对照组、模型组、丁苯酞对照组和丁苯酞治疗组，每组8只。模型组和丁苯酞治疗组大鼠腹腔内注射链脲佐菌素[8](55 mg·kg-1)制备DM模型，3 d后检测大鼠尾静脉血糖，随机血糖>16.7 mmol·L-1为造模成功。DM大鼠常规饲养1周，采用100 g·L-1水合氯醛腹腔注射(3 mL·kg-1)麻醉大鼠，脑立体定位仪固定，备皮和消毒后，沿大鼠头颅的顶中线切开一约2 cm的切口，分离皮下组织，暴露大鼠的前囟，用牙科钻打开大鼠的颅骨，根据大鼠脑立体定位图谱上的定位在大鼠前囟中心点后3.0 mm、中线旁2.0 mm处进行垂直进针，深度约2.9 mm，使用5 μL的微量进样器向大鼠颅内双侧海马组织缓慢注射1 μL凝聚态的Aβ1-40，留针时间约10 min，然后缓慢撤针，缝合皮肤并消毒伤口。术后1周应用Morris水迷宫实验初步检测大鼠的学习记忆能力，将空白对照组大鼠在水迷宫中游至平台所需要的平均时间+5%作为标准，超出该标准的大鼠确定为AD造模成功。空白对照组和丁苯酞对照组大鼠腹腔内注射等体积柠檬酸缓冲液，然后双侧海马组织注射等体积生理盐水。丁苯酞对照组和丁苯酞治疗组大鼠于模型制备成功后1周开始给予丁苯酞(80 mg·kg-1)灌胃，每日2次，连续4周；空白对照组和模型组大鼠分别给予等量实验室专用玉米油进行灌胃。

1.4 Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力(1)定位航行实验：水迷宫是一个直径约为120 cm，水深约30 cm的圆形水池，壁为黑色，水温22 ℃左右，水池被平均划分为4个象限，第2象限(目标象限)距水面约1～2 cm下有一直径为9 cm的黑色圆形平台(目标)。寻找目标平台训练时间为4 d，每日4次，每次约180 s，每2次训练间隔30 min，随机选择每次训练的入水象限，相邻2 d的4次入水象限的顺序不同。从大鼠入水到上台的时间为逃避潜伏期，如果大鼠能够在180 s内上台(其所用的时间为逃避潜伏期)，让其在平台上停留30 s；如果大鼠未在180 s内发现平台，则将其牵引至平台上停留30 s(逃避潜伏期定为180 s)。用摄像头监测大鼠在水池中的游泳踪迹，计算每只大鼠到达平台逃避潜伏期及游泳距离。(2)空间搜索实验：实验第5天撤除平台，将大鼠从非目标象限内放入水中2次，记录大鼠在目标象限内逗留的时间占入水后总游泳时间的百分比及大鼠在目标象限内游泳的距离占入水后总游泳距离的百分比[8-9]。

1.5 各组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE、ChAT及氧化应激指标的测定水迷宫实验完成后，快速断头处死大鼠，即刻取出脑组织，用冷磷酸盐缓冲液冲洗脑组织表面的血迹，然后在冰盘上快速剥离出双侧的大脑皮层及海马组织，分别称质量后冷冻保存于液氮中。使用前取出，分别加入预冷的生理盐水进行匀浆，然后4 ℃下5 000 r·min-1离心15 min，取上清液(即组织匀浆液)进行检测。采用二喹啉甲酸法测定总蛋白含量，对称三硝基苯法检测AchE活性，紫外比色法检测ChAT活性及GSH水平，硫代巴比妥酸法测定MDA 的水平，黄嘌呤氧化酶法检测SOD 的活性。操作严格按照试剂盒说明书的步骤及计算公式进行，使用酶标仪分别检测波长412、324、532、550、420 nm处的吸光度值，并根据说明书中的公式计算各指标的水平。

1.6 各组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6水平检测待测样品的制作同“1.5”中所述，取海马组织的匀浆液进行检测，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测各组大鼠海马组织中IL-1β和IL-6的水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。使用酶标仪测波长450 nm处的吸光度值，绘制标准曲线，计算海马组织中 IL-1β或IL-6的水平。

2 结果

2.1 4组大鼠逃避潜伏期及游泳距离比较结果见表1和表2。训练前3 d，4组大鼠逃避潜伏期及游泳距离比较差异均无统计学意义(P>0.05)。训练第4天，丁苯酞对照组与空白对照组大鼠逃避潜伏期及游泳距离比较差异无统计学意义(P>0.05)；模型组大鼠逃避潜伏期和游泳距离长于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；丁苯酞治疗组大鼠逃避潜伏期和游泳距离短于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 4组大鼠逃避潜伏期比较

表2 4组大鼠游泳距离比较

2.2 4组大鼠在目标象限中游泳时间百分比和游泳距离百分比比较结果见表3。丁苯酞对照组与空白对照组大鼠在目标象限中游泳时间百分比和游泳距离百分比比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠在目标象限内游泳时间百分比和游泳距离百分比均显著低于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；丁苯酞治疗组大鼠在目标象限内游泳时间百分比和游泳距离百分比均显著高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 4组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE、ChAT活性比较结果见表4。丁苯酞对照组与空白对照组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE、ChAT活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较，模型组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE活性显著升高，ChAT活性显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丁苯酞治疗组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE活性显著降低，ChAT活性显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3 4组大鼠在目标象限中游泳时间百分比和游泳距离百分比比较

表4 4组大鼠大脑皮层和海马组织中AchE、ChAT活性比较

2.4 4组大鼠大脑皮层和海马组织中MDA、GSH水平及SOD活性比较结果见表5。丁苯酞对照组与空白对照组大鼠大脑皮层和海马组织中MDA、GSH水平及SOD活性比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与空白对照组比较，模型组大鼠大脑皮层和海马组织中MDA水平升高，SOD活性及GSH水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，丁苯酞治疗组大鼠大脑皮层和海马组织中MDA水平降低，SOD活性及GSH水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.5 4组大鼠海马组织中IL-1β及IL-6水平比较结果见表6。丁苯酞对照组与空白对照组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。模型组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6水平显著高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。丁苯酞治疗组大鼠海马组织中IL-1β、IL-6水平显著低于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表5 4组大鼠大脑皮层和海马组织中MDA、GSH水平及SOD活性比较

表6 4组大鼠海马组织中IL-1β及IL-6水平比较

3 讨论

AD是一种以记忆减退和认知功能障碍为特征的中枢神经退行性疾病[10-11]。据统计，2003年全世界约有2.77亿AD患者[12]。2019年美国约有580万人患有AD，至21世纪中期，AD患者可能会达到1 380万人。2018年，美国为AD患者及其他痴呆患者投入的医疗支出约 2 349亿美元[13]。目前，DM的发病率也呈逐渐上升趋势，国际DM联盟分析显示，预计至2045年，18～99岁人群中DM患者可达6.93亿人。2017年全球用于DM患者的医疗支出费用约为 8 500亿美元[14]。临床上往往有许多患者同时患有DM和AD这2种疾病，在治疗上较为繁琐，因此，寻找单一可以二者兼顾的有效措施具有重要的临床意义。

丁苯酞具有减少氧化应激损伤、抑制炎症反应、改善细胞线粒体功能及抗细胞凋亡等作用[15-16]。有研究发现，丁苯酞能明显改善急性脑梗死及皮层下腔隙性梗死引起的血管性认知功能障碍[17-18]，改善Aβ诱导的细胞损伤[19]，减轻AD大鼠脑内的细胞凋亡[20]，改善AbetaPP/PS1转基因AD小鼠脑内的tau蛋白磷酸化及认知功能障碍[21]。此外，丁苯酞对DM大鼠也具有治疗作用[22-23]。研究发现，丁苯酞可通过抑制氧化应激延缓DM大鼠白内障的发生、发展[22]；丁苯酞还可通过上调海马组织中血管内皮生长因子的表达，抑制caspase-3诱导的细胞凋亡，从而改善DM大鼠的慢性脑损伤[23]。本研究通过水迷宫实验发现，丁苯酞能显著改善DM合并AD大鼠受损的学习记忆功能，本研究还发现，模型组大鼠大脑皮层及海马组织中ChAT活性明显下降，AchE活性增高，丁苯酞治疗组大鼠上述变化明显减轻，提示丁苯酞可通过调节大鼠脑皮层和海马组织内ChAT和AchE活性来调节大鼠的学习记忆功能，且丁苯酞对照组大鼠的上述指标与空白对照组比较差异无统计学意义，说明丁苯酞对正常大鼠不产生影响。

氧化应激和炎症反应在DM及AD的发生发展中均具有重要的地位[24]。MDA、SOD和GSH是反映体内氧化还原状态的重要指标[25]，海马组织中炎症因子IL-1β及IL-6的水平也可直接反映脑内炎症反应的程度[26]。本研究中，丁苯酞可明显提高DM合并AD大鼠大脑皮层及海马组织中SOD活性及GSH水平，降低MDA水平，在对抗氧化应激方面具有一定的作用；且丁苯酞治疗组大鼠海马组织中IL-1β及IL-6水平较模型组明显减少，提示丁苯酞可以减轻DM合并AD大鼠脑组织中的炎症反应，且丁苯酞对照组大鼠的上述指标与空白对照组比较差异无统计学意义，提示丁苯酞对正常大鼠无明显影响。

综上所述，丁苯酞能改善DM合并AD大鼠学习记忆能力，该作用与其调节颅内中枢胆碱能系统的平衡及抗氧化应激、抗炎症反应有关。