荧光定量PCR 检测结核杆菌DNA 的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性研究

王菊红 平顶山市传染病医院，检验科（河南，平顶山，467000）

穆丽平 平顶山市传染病医院，结核科（河南，平顶山，467000）

结核属于传染性较强的疾病，会严重威胁患者的机体健康，甚至是生命安全，临床上在对肺结核患者开展治疗时，需应用规范药物进行治疗，或对患者实施消毒隔离，由此使病菌传播得到有效控制，从而使康复率得以有效提高， 并且还需使患者的休息时间得到保证，指导其开展适量运动，从而使治疗顺利开展［1］。结核病的致病菌为结核分枝杆菌（TB），在对结核病进行诊断时，所参考的重要诊断依据为标本中检测出结核分歧杆菌病原体［2］。 临床上在对可疑结核标本开展检测时， 常用的方法为涂片、抗酸染色、金胺O 荧光染色法、荧光定量PCR 等，上述方法的操作较为简单，检测速度快，同时检测费用低［3］。 目前研究报道显示，荧光定量PCR 是诊断结核病的有效方法之一， 但其研究大多为定性评估，而未重视定量评估［4］。本次研究选取可疑结核病患者1 012 例，探讨荧光定量PCR 检测TB-DNA 的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度的相关性。 报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年1 月至12 月我院收治的可疑结核病患者1 012 例，取TB-DNA 标本1 012 份，包括男778 例，女234 例，年龄16～88 岁，平均（52.36±5.41）岁。

1.2 研究方法

抗酸染色应用贝索热染法染色液，根据《结核病诊断实验室检验规程》 以及试剂说明书开展检测。 镜检结果评价：在300 个不同的视野内无抗酸杆菌，则为阴性；在300 个视野内发现抗酸杆菌数量为1～8 条，则为可疑结果；在100 个视野内发现抗酸杆菌数量为3～9 条， 则为抗酸杆菌阳性1+；在10 个视野内发现抗酸杆菌数量为1～9 条，则为抗酸杆菌阳性2+； 在每个视野内发现抗酸杆菌数量为1～9 条，则为抗酸杆菌阳性3+；在每个视野内发现抗酸杆菌数量超过10 条，则为抗酸杆菌阳性4+。荧光定量PCR 法检测方法： 根据试剂盒说明书开展检测，操作步骤包括样本液化、DNA 提取、扩增试剂准备、加样以及PCR 扩增。反应条件为37 ℃下反应3 min，然后在93 ℃下反应1 min，在93 ℃下5 s，在60 ℃温度下40 s，40 个循环。

1.3 观察指标

（1）涂片染色镜检结果；（2）荧光定量PCR 检测结果和涂片结果间的相关性。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 涂片染色镜检结果分析

1 012 份标本中包括阳性标本241 份， 阴性标本771 份，其中阳性标本中包括18 份可疑阳性，56份1+阳性，63 份2+阳性，84 份3+阳性， 以及20 份4+阳性。

2.2 荧光定量PCR 检测结果和涂片结果的相关性

771 份阴性标本中189 份荧光定量PCR 检测结果为阳性， 结核杆菌DNA 拷贝数大多为102～103数量级；241 份阳性标本中223 份荧光定量PCR 检测阳性，结核杆菌DNA 拷贝数大多为103～104数量级， 与涂片阳性程度表现为正相关 （r=0.325，P＜0.05），如表1。

表1 荧光定量PCR 检测结果和涂片结果间相关性

3 讨论

临床上在对可疑结核标本开展检测时，常用的方法为涂片、抗酸染色及金胺O 荧光染色法，上述方法的操作较为简单，检测速度快，同时检测费用低。 金胺O 染色法所具备的检测特异度超过90%，导致这一情况出现的原因可能和非结核分歧杆菌感染率较低有关。 除此之外，涂片金胺O 染色法无法对结核分歧杆菌的活性进行判断，同时涂片检测结果的特异性以及灵敏度也会受标本中所具备的菌量以及操作人员自身辨识能力的影响。 目前公认的对结核菌进行检测的金标准为结核菌培养，其具备较高的阳性率，同时可对活菌进行确认［5］。但该检测方法的不足之处在于需要耗费较长的检测时间，除此之外，培养基上的菌落特征还需要开展进一步的鉴定和辨别。荧光定量PCR 技术是以分子生物学作为基础，随着研究的深入，其在病毒、慢性生长菌和难生长菌的检测以及鉴定中的应用率不断提升，由于设计引物存在菌属特异性，同时可发挥扩大效应，因此可提升检测结果的可信度［6］。

荧光定量PCR 是依靠荧光共振能量转移原理，应用相应的荧光基团以及淬灭基团来标记核酸探针或引物，再通过核酸杂交以及水解所获取的荧光基团与淬灭基团结合或分开的原理而建立。 本次研究中，应用的一对引物以及荧光双标记探针，可和引物扩增区的一段DNA 模板进行有效结合， 由此促使PCR 技术能够和荧光检测技术实现有效结合，并且在试剂盒内对dUPT-UNG 酶防污染体系予以应用，可有效预防实验污染的情况。 相较于普通的PCR 检测，荧光定量PCR 检测获取的电泳灵敏度较前者高2～3 个数量级，可使检测方法的敏感度明显提高［7］。

本次研究中，1 012 份标本中包括阳性标本241份，阴性标本771 份，其中阳性标本中包括18 份可疑阳性，56 份1+阳性，63 份2+阳性，84 份3+阳性以及20 份4+阳性。 771 份阴性标本中189 份荧光定量PCR 检测结果为阳性， 结核杆菌DNA 拷贝数大多为102～103数量级； 通过理论分析， 荧光定量PCR 检测具备的敏感度明显高于涂片抗酸染色镜检， 而通过本次研究可知， 荧光定量PCR 检测的DNA 拷贝数较涂片阳性样本明显更低。 分析原因，可能是由于荧光定量PCR 阳性检出率的提升主要还是依靠其自身的灵敏度较高；当然也可能存在实验污染的情况，虽然荧光定量PCR 检测中实现全封闭操作，但DNA 提取、样本液化过程中也可能导致污染情况的出现［8］。 本次研究中，241 份阳性标本中223 份荧光定量PCR 检测阳性， 结核杆菌DNA 拷贝数大多为103～104数量级， 与涂片阳性程度表现为正相关，由于本次研究未对样本开展分枝杆菌培养，因此241 份阳性标本中出现阴性样本，首先可能是由于涂片阳性菌属于非结核分枝杆菌；其次是荧光定量PCR 检测过程中发生假阴性的情况。在荧光定量PCR 检测结果为阳性的样本中， 荧光定量PCR 检测结果和涂片结果间呈现为正相关，表明荧光定量PCR 检测具备较高的定量准确度。但在判定二者的相关性时，是以涂片镜检结果真实可靠作为前提，但涂片镜检结果可靠性也可能受到多种因素的影响，如染色质量、样本质量、操作流程是否正确等， 同时涂片镜检结果的阳性判定为半定量性质。因此根据涂片镜检结果来分析荧光定量PCR 的定量功能，可能仅具备相对意义。

综上所述， 荧光定量PCR 检测结核杆菌DNA的拷贝数与涂片抗酸染色镜检阳性程度存在较为明显的相关性，可作为结核杆菌检测的有效方法。