不同来源胶原蛋白对人真皮成纤维细胞生长的影响

罗德威，欧阳辉，黄光春

1.江西中医药大学，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西 南昌 330045；2.南昌傲凡良品科技有限公司，江西 南昌 331799

成纤维细胞（Fibroblasts）是皮肤真皮层构成中最常见的细胞，其作为一种修复细胞可以合成及分泌胶原、细胞外基质和生长因子，在创伤修复、愈合、收缩中起着极其重要的作用［1-3］。皮肤损伤创面的临床治疗方法选择，一直是研究的热点内容。根据以往文献报道，胶原蛋白在皮肤烧伤的修复、治疗和护理中能发挥重要的作用，其能有效地改善伤口烧伤的程度,并起到预防感染的效果［4-6］。本研究运用体外培养人真皮肤成纤维细胞，观察不同来源的胶原蛋白对成纤维细胞生长干预的影响，对各胶原蛋白生物活性进行考察，为进一步研究胶原蛋白提供了基础［7-10］。

1 材料与方法

1.1 实验材料

不同厂家来源胶原蛋白粉、弹性蛋白、复合弹性蛋白、玫瑰花粉、鲑鱼蛋白粉共12 种，具体编号见表1。

表1 胶原蛋白受试样品编号

1.2 实验试剂

DMEM 高糖培养基（GE 有限公司）；胰蛋白酶（Solarbio 有限公司）；青霉素、链霉素（Solarbio 有限公司）；胎牛血清（Invitrogen 有限公司）；四氮甲唑蓝（MTT，北京索莱宝科技有限公司）；SDS、异丁醇、盐酸均试剂均为AR 级（国药试剂）；人真皮成纤维细胞株（HDF-a 细胞，中科院上海细胞库，Lot.No 13056）。

1.3 实验仪器

3111 细胞培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）；倒置显微镜（上海皆准仪器设备有限公司）；DK-420S 恒温水浴锅（江苏荣华仪器制造有限公司）；124986D 微量进样器（Eppendorf 公司）；LEICA DMI3000 B 倒置显微镜（莱卡公司）；Infinite M2000 PRO 全波长酶标仪（TECAN 有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 不同来源胶原蛋白样品处理 根据实验设计，配制10 000 μg/mL不同来源胶原蛋白作为评价母液，并用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，并稀释至5 000、2 000、1 000、500、250、125、100、62.5 μg/mL 共8 个浓度，4 ℃保存备用。

1.4.2 四氮甲唑蓝（MTT）法检测胶原蛋白 对HDF-a 细胞生长的影响将HDF-a 细胞用胰酶消化，吹打计数，稀释至1×105个/mL，每孔100 μL 接种于96 孔细胞培养板中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育24 h。24 h 后吸出培养基，样品组加入不同浓度胶原蛋白100 μL，空白对照组加入等量的细胞培养基，每个浓度设5 个复孔，继续孵育48 h后每孔加入20 μL（5 mg/mL）MTT，再于细胞培养箱中培养4 h，每孔加入100 μL 浓度10%的SDS 三联溶解液，静置孵育过夜后，于酶标仪上测定吸光度（检测波长490 nm）。细胞存活率（%）=实验组吸光度/空白对照组吸光度均值×100。

2 结果

由（图1）可见，1 号、2 号除在浓度100 μg/mL 外，在其他各浓度对成纤维细胞生长均为促进作用。4号、8 号、10 号、11 号和12 号，于本实验的不同浓度下对成纤维细胞的生长均起到促进效果，且10 号对人真皮成纤维细胞生长促进作用最为显著。9 号除在浓度62.5 μg/mL 外，在其他各浓度下作用成纤维细胞均起到了促进生长效果。5 号在本次实验设置的浓度下对成纤维细胞生长均为抑制作用。3 号、6 号除了在浓度为10 000 μg/mL 情况之外，在其他浓度下对成纤维细胞生长均为抑制作用。7 号除了在10 000 μg/mL、2 000 μg/mL 情况外，在其他浓度下对成纤维细胞生长均为抑制作用。具体影响情况见表2。

图1 胶原蛋白在不同浓度下对人真皮成纤维细胞存活率的影响

表2 胶原蛋白对人真皮成纤维细胞生长影响

3 讨论

MTT 检测法结果显示，不同来源的胶原蛋白，大部分对HDF-a 细胞均能起到生长促进的作用，验证了胶原蛋白可以作用临床皮肤损伤创面治疗使用。过高或过低浓度的胶原蛋白，均不能起到最佳促进纤维蛋白生长作用，在临床中要选择最适浓度进行治疗。部分胶原蛋白对HDF-a 细胞生长起到了抑制作用，这种情况的出现可能与对HDF-a 细胞起到了免疫排斥作用有关，在临床使用中，需进一步甄别不同来源胶原蛋白，杜绝不合理胶原蛋白使用。

本研究中，考察了12 个批次来源胶原蛋白对HDF-a 细胞生长的影响。各批次样品设置了10 000 μg～62.5 μg 范围内9 个浓度值，涵盖范围广。对胶原蛋白发挥对细胞活性影响进行了有效的筛选，对于解释胶原蛋白对成纤维细胞生长调控提供了基础。本次研究只针对体外活性进行了考察，由于创面损伤修复过程发生在复杂体内，关于胶原蛋白参与真皮组织修复的内在机制，尚有待于进一步探索［11-13］。

胶原蛋白因其独特的三维结构和良好的生物相容性，日渐成为生物医学、功能性保健品领域的热门研究课题［14-16］。皮肤损伤创面治疗中使用具有优良修复功能的胶原蛋白，展示出了极具前景的治疗效果，但关于胶原蛋白促进成纤维细胞生长在基因水平、蛋白水平及分子水平的具体作用机制还有待深入研究。