4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)细菌内毒素检查法的研究

焉媛媛 林 鹏 赵志龙 王秀英

辽宁省检验检测认证中心，辽宁 沈阳 110036

4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)为伊立替康脂质体注射液中的一种辅料。外观是白色结晶粉末，含量：99.0%，分子式: C8H18N2O4S，分子量: 238.31，PH值范围：6.8-8.2，性质比较稳定，贮存于2-8℃，阴凉干燥环境，用于生物缓冲液，对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的PH范围，提升药物疗效，适用于医药产品的原料中。为控制产品质量，确保临床用药安全开展此项研究工作。

1 材料与仪器

1.1受试物：

1.114-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 规格原料药,批号SLBP6989V，国药一心制药有限公司。2 . 鲎试剂：湛江安度斯生物有限公司，批号1705082，规格0.1ml，灵敏度0.125EU·ml-1，湛江博康海洋生物有限公司，批号1704110，规格0.1ml，灵敏度0.125EU·ml-1。3. 细菌内毒素检查用水：湛江安度斯生物有限公司，批号1703210，规格2ml。4. 细菌内毒素工作标准品：批号150601-201782， 效价60EU·支-1，中国食品药品检定研究院。5. 仪器设备：电子天平，CP124S型 ，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司; 内毒素凝胶法测定仪，型号ET-96，天津市天大天发科技有限公司。

2 方法与结果

2.1鲎试剂灵敏度(λ)的复核试验 按照《中国药典》2015年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”进行检查。使用灵敏度为0.125 EU·ml-1的鲎试剂。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1。取复溶后的0.1ml鲎试剂溶液18支，其中16支分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每个内毒素水平平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。加完样品后，轻轻混匀，37±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度标定结果

结果表明，两个批次的鲎试剂标定结果均在0.5λ～2λ之间可用于细菌内毒素检查。

2.2细菌内毒素限值的确定 根据制剂处方工艺，伊立替康脂质体注射液中盐酸伊立替康与HEPES的投料质量比基本一致，因此HEPES内毒素限值可以参考盐酸伊立替康的限值来确定。参照《中国药典》2015年版四部通则9301“注射剂安全性检查法应用指导原则”及1143“细菌内毒素检查法”进行细菌内毒素限值的确定，并求得最大无干扰浓度。

本品最大用量为：L=K·M-1

M为人用每公斤体重每小时最大剂量，临床用法用量：70mg·(m2)-1，静脉滴注90分钟以上，每2周一次。

K为静脉给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量,为5EU·(Kg·h)-1。

计算本品限值：L = K·M-1= 5EU·(kg·h)-1/70mg·(m2·1.5h)-1×0.027= 4EU·mg-1。

根据“化学药品注射剂安全性检查法应用指导原则”要求，本品理论限值为4EU·mg-1，本品申报限值为1EU·mg-1，约为计算限值的1/3，限值设置合理。

2.3供试品干扰试验预试验 按照《中国药典》2015年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”检查。使用灵敏度为0.125 EU·ml-1的鲎试剂，供试品浓度为0.2mg·ml-1溶液，阴性对照为细菌内毒素检查用水，阳性对照为0.25EU·ml-1内毒素溶液，供试品阳性对照为以供试液稀释的0.25EU·ml-1的内毒素溶液，加完样品后，鲎试剂管用封口膜封好，轻轻混匀，37±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。结果见表2。

表2 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干扰预试验结果

结果表明，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液细菌内毒素检查符合规定，初步确定0.2mg/ml溶液为最大无干扰浓度，0.2mg·ml-1溶液及以下浓度对样品无干扰。

2.4供试品干扰试验 按《中国药典》2015年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”进行干扰试验，使用浓度为0.2mg·ml-1的供试品溶液。使用湛江安度斯生物有限公司和湛江博康海洋生物有限公司生产的鲎试剂，灵敏度分别为0.125 EU·ml-1。将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水稀释至0.25、0.125、0.06、0.03 EU·ml-1，供试品组用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液代替细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标准品稀释至0.25、0.125、0.06、0.03EU·ml-1，加完样品后，鲎试剂管用封口膜封好，轻轻混匀，37±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。结果见表3。

表3 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)干扰试验结果

结果表明，用两个厂家生产的鲎试剂进行干扰试验，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)0.2mg·ml-1溶液对鲎试剂无干扰。

2.5细菌内毒素检查 根据本品临床用法用量，计算得出其细菌内毒素限值参考标准，经干扰试验确证，其细菌内毒素限值标准可拟定为“每1mg中含内毒素的量应小于1EU”。

计算公式为：C=λ/L =0.125EU/ml/1EU/mg=0.1mg/ml按《中国药典》2015年版四部通则1143“细菌内毒素检查法”检查。使用灵敏度为0.125EU·ml-1的鲎试剂，供试品浓度为0.2mg·ml-1溶液，阴性对照为细菌内毒素检查用水，阳性对照为0.25EU·ml-1内毒素溶液，供试品阳性对照为以供试品2倍稀释液稀释的0.25EU·ml-1的内毒素溶液，加完样品后，轻轻混匀，37±1℃保温1小时，1小时后记录试验结果。结果见表4。

表4 细菌内毒素检查试验结果

结果表明，按照拟定标准检验，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)细菌内毒素检查符合规定。

3 讨 论

(一) 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)临床用法用量：70mg·(m2)-1，静脉滴注90分钟以上，每2周一次。本品内毒素限值拟定为1EU·mg-1，对1批样品细菌内毒素检查符合规定。4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)是辅料，也是生物缓冲液，无细胞毒性，可以减小伊立替康脂质体注射液引起的毒性反应。

(二)细菌内毒素检查法和传统热原检查法的比较，细菌内毒素检查法用鲎试剂其灵敏度高，准确性强，操作方便，受客观影响因素较少；热原检查法，需要用家兔做试验，成本高，误差大，受客观影响因素较多。现在越来越多的药品施行细菌内毒素检查法。

(三)伊立替康脂质体注射液，是抗肿瘤药物，药理作用为伊立替康是半合成喜树碱的衍生物，它是一种治疗转移性结肠癌的有效药物。喜树碱可特异性地与拓扑异构酶Ⅰ结合，后者诱导可逆性单链断裂，从而使DNA双链结构解旋；伊立替康及其活性代谢物SN-38可与拓扑异构酶Ⅰ—DNA复合物结合，从而阻止断裂单链的再连接。2015年美国FDA批准伊立替康脂质体注射液用于治疗晚期胰腺癌。它可以使肿瘤增长开始时间延迟，伊立替康脂质体注射液与氟尿嘧啶/亚叶酸联合用药可以使患者平均生存期延长为6.1个月，而单纯用伊立替康脂质体注射液治疗患者生存期未见改善。另外，伊立替康脂质体注射液还是广谱抗肿瘤药物，对乳腺癌、胃腺癌都有抗肿瘤活性，还能抑制乙酰胆碱酯酶。伊立替康脂质体注射液发展前景广阔，值得深入研究。