环状RNA circHIPK3在儿童哮喘中的表达和作用研究

梁秋妍 郑红梅 付劲蓉 刘丽娟 张晓波 钱莉玲 周玉峰,2

儿童哮喘是一种慢性炎症性气道疾病，严重影响患儿的身心健康，其发病机制目前尚未完全明确[1]。1990至2010年，我国<14岁儿童哮喘的累积患病率上升了2.8倍[2]，这一现象无法用DNA序列的改变来解释，表观遗传学机制在其中发挥了重要作用[3, 4]。表观遗传学是不依赖DNA序列变化、由染色质改变产生、可稳定遗传的表型，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA等。

环状RNA(circRNA) 是一种经特殊剪切而产生的共价闭合环状内源性非编码RNA，在真核细胞中广泛表达[5, 6]。环状RNAcircHIPK3(hsa_circ_0000284)/circHIPK3(mmu_circ_0001052)是来源于HIPK3基因的一个环状RNA[7]。有文献报道[8]，circHIPK3在过敏性鼻炎中上调，并通过靶向miR-495促进Th2细胞的分化来影响过敏性鼻炎的鼻部症状。因为T细胞分化在哮喘的发病过程中也起着极其重要的作用，因此推测circHIPK3可能在哮喘中也发挥重要作用，本研究旨在检测circHIPK3在哮喘患儿和哮喘小鼠模型的表达，并进行相关性分析研究。

1 方法

1.1 伦理和知情同意 本研究的实验方案获得复旦大学附属儿科医院(我院)伦理委员会批准(复儿伦审[2016]141号)。本研究获得哮喘组患儿和对照组儿童家长的口头知情同意，采血用于本研究检测。

1.2 哮喘组纳入和排除标准 纳入2017年8月11日至2019年8月5日在我院呼吸科门诊诊断为哮喘的患儿，诊断标准参照2016版《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[2]。排除合并其他呼吸道疾病(如肺炎)、 心血管系统疾病、神经系统疾病者。

1.3 对照组纳入和排除标准：为我院健康体检门诊的体检儿童，排除有过敏史及近期呼吸道感染者。

1.4 外周血单个核细胞(PBMCs)提取 采用密度梯度离心法，操作参考文献[9]。

1.5 小鼠哮喘模型的构建和肺组织提取 采用6～8周龄SPF级C57BL/6品系雌性小鼠(上海斯莱克实验动物公司)，饲养于SPF级实验动物房，操作遵守实验动物伦理原则。以PBS处理作为对照，采用蟑螂提取物(CRE)诱导小鼠构建哮喘模型，具体步骤参考文献[10]。

1.6 RNA提取、逆转录和qPCR 采用Trizol法提取RNA，分别用Takara逆转录试剂盒和qPCR试剂盒进行RNA逆转录和实时定量PCR，步骤同文献[9]，引物序列见表1。参照Takara的SYBR GREEN试剂说明书的qPCR反应二步法进行操作。β-actin为内参，数据分析采用2-△△CT法。

1.7 miRNA靶向性分析 通过circinteractome网站(https://circinteractome.nia.nih.gov/)查找circHIPK3结合的miRNA，通过pubmed查找miRNA成熟序列和T-bet3'UTR序列，通过RNA22网站(https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/) 进行相关序列配对分析。

1.8 GEO 数据库分析 通过搜索筛选，查找儿童哮喘相关miRNA数据库GSE120172，经GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE120172)进行分组分析。

1.9 统计学方法 数据采用 GraphPad Prism 8 统计软件处理。计量资料如符合正态分布，以均数±标准误表示。计数资料以n(%)表示。计量资料符合正态分布且方差齐性的两组资料采用两独立样本t检验分析；不符合正态分布或方差不齐的，采用非参数检验的Mann-Whitney U检验。对满足双变量呈正态分布的资料用Pearson检验进行直线相关分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 哮喘组43例，均为轻度哮喘，男35例，女8例，中位年龄 6.5(4～10)岁。 外周血平均嗜酸性粒细胞(EOS)为(445±327)(正常值60～300)个·μL-1；26例检测了血清总IgE(IU·mL-1)，<100者10例(38.5%)，～200者7例(26.9%)，>200者9例(34.6%)；33例行肺功能检查，17例异常(51.5%)。

对照组28例，男22例，女6例，中位年龄 6.4(4～10)岁。

2.2circHIPK3和T-bet在哮喘组和对照组PBMCs中的表达 图1A显示，与对照组相比，circHIPK3在哮喘组PBMCs中低表达 (t=4.627，P<0.001)；图1B显示，T细胞分化关键转录因子T-bet在哮喘组也呈低表达(t=2.727,P<0.01)；图1C显示，在哮喘患儿中circHIPK3与T-bet呈正相关(R=0.483 0，P=0.0007)。

2.3circHIPK3和T-bet在哮喘小鼠肺组织中的表达 图2A显示，与PBS处理的对照组小鼠相比，circHIPK3在哮喘小鼠肺组织中呈低表达(t=6.438，p<0.001)，T-bet表达也在哮喘组中明显下降(t=10.280，P<0.001，图2B)，二者呈正相关(R=0.897，P<0.001，图2C)。

图1 circHIPK3、T-bet在哮喘患儿和健康对照PBMCs中的表达及其相关性

图2 circHIPK3和T-bet在小鼠哮喘模型中的表达

2.4circHIPK3作用靶点的生物信息学分析circHIPK3主要表达于细胞质中[7, 11, 12]，故推测circHIPK3可能在细胞质中作为一种“海绵体”吸附miRNA而影响T-bet的表达。通过circinteractome网站预测circHIPK3结合的miRNA(图3A)，miRWalk 网站预测靶向T-bet的miRNA，将两组数据叠加，发现hsa-miR-485-3p、hsa-miR-1290、hsa-miR-326与circHIPK3和T-bet均有结合的可能(图3B)。

图3 circHIPK3可通过竞争结合miR-485-3p影响T-bet

检索GEO数据库发现，在哮喘患儿中hsa-miR-485-3p表达明显上调(图3C)，且已有文献报道circHIPK3可以吸附hsa-miR-485-3p[12]。进一步通过生物网站分析发现，circHIPK3、hsa-miR-485-3p、T-bet存在碱基互补配对关系(图3D)。

2.5circHIPK3与儿童哮喘临床指标的相关性 图4显示，在哮喘患儿中，circHIPK3与外周血EOS呈弱负相关，表明circHIPK3可能影响哮喘的炎症表现。

图4 外周血嗜酸性粒细胞与circHIPK3表达的相关性分析

3 讨论

环状RNA具有重要的基因调控功能。近年来，已有相关文献报道circHIPK3在多种疾病的发病机制中发挥重要作用[7, 12, 13]。Huang等[14]发现，环状RNA Hsa_circ_0005519通过调节CD4+T细胞中的miRNA hsa-let-7a-5p来影响成人哮喘。目前尚无环状RNA在儿童哮喘中的研究报道。

Zhu等[8]报道，circHIPK3在过敏性鼻炎中表达上调，通过调节miR-495来影响Th2细胞的分化。本研究显示，circHIPK3在哮喘患儿PBMC中呈现明显低表达，且与转录因子T-bet的表达正相关；在小鼠哮喘模型肺组织中的实验结果与之一致。这与circHIPK3在过敏性鼻炎中的表达情况不同，表明circHIPK3在过敏性鼻炎和哮喘中可能有不同的作用机制。

文献报道，circHIPK3可与miR-485-3p结合并负向调控其表达[12]。本文通过miRWalk 网站预测发现T-bet是miR-485-3p的靶基因。通过GEO数据库发现在哮喘患者中hsa-miR-485-3p表达明显上调。该结果与先前文献报道[15]一致。本文结果提示哮喘患儿circHIPK3减少，可能导致了细胞中游离的miR-485-3p增多，进而使T-bet表达下降，引起Th1/Th2失衡，参与哮喘的发生发展进程(图5)。T-bet转录因子促进T细胞向Th1细胞分化，而GATA3转录因子促进T细胞向Th2细胞分化。在哮喘中，Th2细胞及其细胞因子主导形成慢性炎症，Th1细胞分化下调。Th1/Th2细胞分化失衡在哮喘中具有重要病理生理意义[16]。因此，circHIPK3-hsa-miR-485-3p-T-bet轴的发现，将可能为哮喘的防治提供新的靶点。

图5 circHIPK3/miR-485-3p/T-bet在哮喘中的作用模式图

本研究局限性：研究利用相关性分析在哮喘患儿和哮喘小鼠模型中发现了环状RNAcircHIPK3与T-bet相关，但未通过基因功能实验在细胞或者动物水平进一步证实circHIPK3在体内外是否具有调控T-bet以及影响哮喘表型的功能作用；根据ceRNA理论，利用生物信息技术结合GEO数据库的公共数据、已发表文献辅助验证，分析得出circHIPK3/miR-485-3p/T-bet可能存在的理论，但尚未通过相关实验直接证明。