高分辨气质联用法的实验课程建设

王 慧，燕少玮

（哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室，哈尔滨 150090）

0 引言

气相色谱质谱联用法（GC-MS）由于具有灵敏度高、选择性好、分离和鉴定同时进行等优点，已经逐步成为环境领域中非常重要的分析方法［1-5］。常规方法中通常用电子轰击电离源（EI）结合单四级杆质量分析器，这导致方法的分辨率较差，且目标物的分子离子峰经常在电离过程中丢失，为分析复杂基质中的痕量目标物带来很大的难度。低能量电子轰击电离源（LE-EI）结合高分辨气质联用技术（GC-QTOF-MS）可以很好地解决上述问题，它不仅提高了方法的选择性和灵敏度，而且可以降低假阳性结果的概率。此外，高分辨质谱支持结构测定，可以推断未知物的化学元素和分子式。近年来，越来越多的研究生需要应用高分辨质谱完成他们的科学研究。

结合环境学科的特点和研究生科研项目的需求，2018 年我校环境学院在研究生综合实验课程中，开设了“高分辨气质联用法分析环境样品中的林丹”实验。该实验的开展响应了学校提出的以大型精密仪器为教学平台，结合经典实验样品或学科前沿内容，开展实验教学的教改思路。本实验以低能量电子轰击离子源结合高分辨气质联用技术为核心内容，通过实验设计和条件优化使学生了解高分辨气质联用仪的工作原理，熟悉定性和定量等分析检测技术，掌握环境样品常用预处理方法的具体操作。

1 实验教学方案

1.1 实验内容的选取

在仪器分析实验教学中，选取合适的实验内容非常重要［6-9］。内容的设计不仅要着眼于学生的知识与技能的培养，还要兼顾学生的学习兴趣，重视学生的感受，使其能在实验过程中充分展示主动性和创造性。

长期的教学实践表明，与实际生活相关的实验内容及学科前沿内容，往往更能引起学生的兴趣，同时还能培养学生的科学思维能力和科研敏锐度。基于以上考虑，选取“环境样品中的林丹”作为实验对象。林丹作为典型的持久性有机污染物在媒体中常见报道，能极大地吸引学生的兴趣［10］。同时，该物质在环境科学研究中具有重要意义，是目前国内外研究的热点内容［11-13］。

1.2 实验基本原理

高分辨气质联用技术是指气相色谱（GC）结合四级杆串联飞行时间质谱（QTOF-MS）技术，该技术结合了GC的高效分离能力和QTOF-MS的高灵敏度、高分辨率和极强的选择性分离检测技术。GC-QTOF-MS 样品分析过程包括两步：①待测样品通过进样口加热气化后进入GC，通过在流动相和固定相间反复交换，待测样品中的不同成分由毛细管柱分离；②从GC 流出的被分离组分依次进入离子源被离子化，先在四级杆质量分析器中根据质荷比进行分离，再根据离子在飞行管中的飞行时间推算离子的精确质量，具有相同质荷比的离子会同时到达检测器，检测器将离子信号转变为电信号，传送至数据处理系统。

本实验所用质谱仪的离子源是低能量电子轰击电离源，该离子源与化学电离源类似，为“软”电离源，可以降低化合物在电离过程中发生分解的概率，通常仅丢失一个电子，产生M+准分子离子，便于进行分子量确认。多级质谱分析则是以六级杆作为碰撞池，使准分子离子与氮分子在碰撞池中发生碰撞，进而多级裂解获得子离子碎片，实现对未知物的高质量定性分析。

分析环境样品中的痕量物质最大的挑战，即富集目标物浓度使其大于仪器分析的检出限，因此样品的预处理过程是GC-QTOF-MS 分析的一个重要环节，样品处理效果的好坏直接影响后续仪器测试所得数据的准确性。环境样品的预处理方法很多，有液液萃取、固相萃取、固相微萃取法、快速溶剂萃取、微波辅助萃取和超声辅助萃取等［14-16］。其中，固相萃取法（SPE）和快速溶剂萃取法（ASE）由于萃取效率高、有机溶剂使用量少、分离操作时间短等优点在环境领域应用较为广泛。ASE是一种在较高压力和较高温度下，用常规溶剂对固体样品进行萃取的前处理方法。增加溶剂的温度能够加速目标物的萃取，压力的增加能够使溶剂的沸点也相应地增加，从而使溶剂在萃取的过程中始终保持液态，进而在短时间内实现对复杂基质中痕量目标物的高效萃取。SPE是一种基于吸附剂的萃取技术，其基本原理类似于液相色谱，吸附剂作为固定相，而液态样品作为流动相。当样品通过萃取柱时，流动相中目标物被保留在吸附剂上，杂质和共萃取物通过淋洗等方法去除，随后选择合适的溶剂将目标物洗脱下来，从而达到目标物分离、净化和浓缩的目的。

1.3 实验仪器和材料

实验仪器：美国安捷伦气相色谱-四级杆串联飞行时间质谱联用仪、美国SUPELCO 固相萃取装置、美国赛默飞ASE-350 快速溶剂萃取仪、德国默克密理博Milli-Q IQ 7000 超纯水系统、精密电子天平。

实验耗材和试剂：甲醇、正己烷、二氯甲烷均为色谱级、C18 固相萃取柱（Waters Oasis 6 mL，200 mg）。

1.4 实验步骤

（1）环境样品的制备。在农场采集土壤样品（50 g），加入适量的林丹标准溶液，使其在土壤中的浓度为0.2 μg/g，随后将加标土壤混匀，通风橱中放置24 h，待溶剂完全挥发后进行实验。

在松花江流域采集地表水（1 L），经0.45 μm 滤膜过滤后加入适量的林丹标准溶液，使其在环境水中的浓度为0.5 μg/L。

（2）土壤样品快速溶剂萃取。称取2 g样品放入萃取罐，以正己烷作为萃取溶剂，温度设置为80 ℃，预热时间5 min，静态萃取10 min，循环2 次，润洗池体积60%，润洗时间60 s。待萃取完成后。将上述所得的萃取液用氮吹仪浓缩至低于0.8 mL，加入正己烷定容至1 mL。所得的溶液经0.45 μm 滤膜过滤后用于GC-QTOF-MS分析。

（3）地表水样品固相萃取。依次用4 mL 甲醇和5 mL超纯水对固相萃取柱进行活化。将100 mL加标水样泵入活化后的固相萃取柱，通过活塞和真空泵控制流速为5 mL/min。再用超纯水对固相萃取柱进行净化以去除其他杂质。在60 kPa压力下，用氮气干燥固相萃取柱3 min。将5 mL 甲醇泵入固相萃取柱，将C18吸附的目标物洗脱下来，通过活塞和真空泵控制流速为1 滴/s。将上述所得的洗脱液用氮吹仪浓缩至低于0.2 mL，加入二氯甲烷定容至1 mL用于GC-QTOFMS分析。

（4）气相色谱-高分辨质谱联用仪运行条件。气相色谱使用Agilent 7890B系统，色谱柱为Agilent HP-5M毛细管柱（φ0.25 mm×30 m，0.25 μm）；柱箱初始温度120 ℃保持2 min，随后以10 ℃/min的速度升温至300 ℃。进样口温度250 ℃；不分流模式进样；进样体积1 μL；高纯氦气为载气，流速为1.2 mL/min。

高分辨质谱采用Agilent 7250 四级杆串联飞行时间质谱仪，离子源为低能量电子轰击离子源，能量15 eV；高纯氮气为碰撞气，流速为1.5 mL/min；扫描方式为全扫描，扫描范围50～500 amu。

2 结果分析与讨论

2.1 定性分析

首先分析林丹标准溶液（250 μg/L），图1（a）所示为林丹的高分辨质谱总离子流图（TIC）。林丹的高分辨质谱图如图1（b）所示，横坐标为质荷比m/z，纵坐标为相对丰度，得到了m/z=180.937 0 和182.934 2这两个特征离子峰，将特征离子输入NIST17 谱库进行比对，获得目标物分子结构式。以质谱峰的保留时间和特征离子碎片作为定性依据，对环境样品中的目标物进行定性分析，并引导学生使用NIST17 谱库对样品萃取液中的未知物进行定性。

选择离子谱图（EIC）可以有效降低复杂基质对目标物定性的干扰。如图1（c）所示，与TIC 相比，EIC可以将目标物的检出限降低10 倍。在分析土壤样品萃取液时，共萃取物较多，对林丹的分析造成了一定的干扰，学生应用EIC 选择性地考察感兴趣的离子（180.937 2 和182.934 2），很好地解决了这一问题。

图1 林丹标准溶液分析结果

为激发学生兴趣，可鼓励学生优化离子源电离能量值，并考察电子轰击能量对方法灵敏度的影响。当设置电离能量为15 eV时，得到的离子碎片较少，基峰峰高比电离能量为70 eV时要低。但在分析环境样品中的痕量目标物时，较低的电离能量能够有效降低基线噪声，提高方法的灵敏度。

2.2 定量分析

常用的定量方法包括外标法和内标法。在实验前的课堂提问中发现，约69%的同学仅了解内标法这一概念，从未具体应用过。本实验将外标法和内标法进行对比，加深学生对定量方法的理解，并掌握两种方法的具体操作步骤。

（1）外标法。用二氯甲烷对林丹储备液进行逐级稀释，获得一系列浓度范围为5～500 μg/L 的林丹标准溶液。将配置好的标准溶液用GC-TOF-MS 进行分析，以标准溶液浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）内标法。以13C 六氯苯作为内标物。用二氯甲烷对林丹储备液进行逐级稀释，获得一系列浓度范围为5～500 μg/L的林丹标准溶液。在不同浓度的林丹标准溶液中，添加等量的内标物，使13C 六氯苯在一系列林丹标准溶液中的浓度均为250 μg/L。将配置好的标准溶液用GC-TOF-MS进行分析，以标准溶液中林丹和13C六氯苯的浓度比值为横坐标，以林丹和13C六氯苯的峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线。

内标法和外标法获得的两条标准曲线如图2 所示。学生通过比较两条曲线的相关系数（R2）可知，在5～500 μg/L的浓度范围内，内标法的线性相关系数较高，因为它能校准样品基质、进样偏差和基线漂移等干扰因素引入的误差。

图2 外标法和内标法获得的标准曲线对比

方法的检出限和定量下限分别由信噪比的3 倍信号和10 倍信号所对应的浓度值得出。在土壤样品萃取液和地表水样品洗脱液中添加内标物，随后用GCTOF-MS进行分析，将峰面积带入内标法标准曲线方程，获得林丹在环境样品中的浓度值，并计算方法的精密度和准确度。相关定性和定量分析结果见表1。

表1 定性和定量分析结果

2.3 “未知物”分子式的判定

在定性分析地表水萃取溶液时，基质中有一个明显的质谱峰m/z=201.976 1（见图3）。将该物质作为共萃取的未知物，对其分子式进行推断，具体步骤为：①学生在定性分析软件“生成分子式”中输入精确分子量，同时选择失去一个电子模式，选择可能包含的元素C，H，N，O，S，Cl，由软件自动生成可能的分子式；②由于目标物为不饱和结构，碳的个数≤（2n +2）氢的个数，将误差限制在7.5 ×10-6；③如果化合物含有的氮分子为奇数，那么化合物的分子量也为奇数，目标物的分子量为201.976 7（电子质量为0.000 55 u），可见其含有偶数个氮，学生可以排除含有奇数个氮分子的分子式；④X+1 同位素（13C）的相对强度可以用来估计分子中碳的数量，即13C 的相对强度（%）=1.1 ×碳的数量，m/z=202.978 5 相对于m/z=201.976 1 为5.7%，由此推断碳的数量为5～6；⑤自然界中35Cl和37Cl存在比例为3∶1，因此如果目标物的分子式中含有1 个氯，那么同位素X +2 的相对强度应为33.3%，未知物同位素X+2 的相对强度为34.5%，这意味着含有1 个氯元素；⑥自然界中34S 相对32S 的丰度为4.6%，排除了分子式中含硫的可能性。

图3 未知化合物基峰及其同位素质谱峰的相对强度

经过以上推断，获得最可能的分子式为C6H3ClN2O4。学生将其输入化合物数据库，获得化合物名称为“二硝基氯苯”，通过NIST 17 谱库进行特征离子碎片比对，进一步证实该未知物为二硝基氯苯。

3 教学实践要点

本实验的难点在于实验内容多，注意事项多，影响因素多。而且大部分一年级的研究生在本科阶段接触大型仪器较少，同时对样品预处理方法不熟悉，因此很难在短时间内既能掌握仪器原理和操作，又能牢记分子式判定规则，同时完成实际样品的快速分析。因此，在实验教学中，鼓励学生利用思维导图构筑课堂笔记和实验记录。学生可以在有效的时间内将教师在课堂上所讲的内容完整地体现在思维导图中，有助于其课后在大脑中还原课上所学内容。利用思维导图来帮助分析，可以提高学生对高分辨气质联用分析的认知能力（见图4）。而且，思维导图能够将研究生综合实验中多个单元的学习内容进行深度整合，建立起课程内部以及课程之间的知识网络，然后按图索骥，找到对应知识点深入学习，强化记忆。同时，使用思维导图绘制实验记录，方便教师了解学生对知识的掌握情况，并对接下来的教学进行及时调整，实现教学相长。

实验完成后学生需撰写实验报告；同时，教师还会通过课前讲解、课间提问、问卷调查等方式引导学生进行讨论，交流自己的实验体会和经验，分析实验过程中存在的问题，启发学生思考解决问题的对策，总结实验的得失，将所学仪器分析的知识点进行梳理、归纳、总结，形成一个相互关联的知识网络。因此，实验报告中除包含对数据的处理和分析外，还包含学生的实验心得。

图4 高分辨气质联用法实验原理思维导图

4 结语

实验教学是环境专业研究生培养的重要环节。“高分辨气质联用法分析环境样品中的林丹”实验课共6 学时，3 学时进行实验原理讲解和环境样品前处理实验，获取目标萃取物或洗脱物后将样品进行浓缩。3 学时进行高分辨气质联用仪的讲解和操作，实验结果由学生在课后进行分析。该实验涉及样品预处理技术、现代色谱及质谱学、精确质量计算、同位素分布和思维导图绘制等，具有知识点多、综合性强的特点，可全面提升学生的科研能力和实验操作能力。到目前，该实验课已开设3 年，受到学生广泛好评，实验效果较理想。