特征真菌对喷气燃料性质的影响

苏 鹏，牛明明，熊 云，谷科城，许天瑜，韩 森

(1.陆军勤务学院，重庆 401311；2.解放军第32726部队;3.解放军第92229部队)

喷气燃料在储存过程中经常会出现微生物污染问题[1-2]。微生物在喷气燃料储存过程中生长繁殖到一定程度，会对喷气燃料的腐蚀性、洁净性等产生一定影响，进而影响油料储供设施的使用寿命和用油装备的使用安全[3-4]。目前关于微生物对喷气燃料性质影响的研究多是基于一种真菌展开，而实际喷气燃料在储存过程中会面临多种微生物污染的情况，由微生物引起的喷气燃料性质变差也往往是多种菌群共同作用的结果[5-6]。此外，现阶段关于微生物对喷气燃料性质的影响研究很少结合喷气燃料中微生物的污染总量，且污染总量与喷气燃料性质衰变之间的关系也尚不明确。

本研究以课题组前期分离鉴定的喷气燃料特征微生物为对象，依据我国喷气燃料中特征真菌的丰度比构建混合特征真菌，系统研究了喷气燃料特征真菌对喷气燃料外观、总酸值、银片腐蚀、水反应试验及燃料表面张力等指标的影响；同时结合三磷酸腺苷(ATP)生物荧光检测法，考察微生物污染总量与喷气燃料质量指标之间的关系，为喷气燃料微生物污染的日常监控和预警提供依据。

1 实 验

1.1 原料及仪器

3号喷气燃料，取自中国石化镇海炼化分公司；喷气燃料特征真菌，枝孢霉菌(Amorphothecaresina)、互隔交链孢菌(Alternariaalternata)、局限青霉(Penicilliumrestrictum)、帚状曲霉(Aspergilluspenicillioides)、毛壳属(Chaetomiumglobosum)为课题组前期培养并鉴定过的真菌[5-6]。氢氧化钾、异丙醇、甲苯、邻苯二甲酸氢钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾，分析纯，成都市科隆化学品有限公司提供。ATP荧光检测所用酶、裂解液、提取液均由德国Merck公司提供。

超净工作台ECO 1.2，美国Thermo Fisher公司产品；快速自动高压灭菌器SX-300，日本TOMY Digital Biology公司产品；循环水式多用真空泵SHB-ⅢA，郑州市亚荣仪器有限公司产品；全自动表界面张力仪JYW-200C，承德鼎盛试验机检测设备有限公司产品；石油产品腐蚀试验多用仪NJ-1A，南京陵武新技术应用开发研究中心产品；纯水仪Milli-Q，美国Millipore公司产品；ATP荧光检测仪HY-LITE2，德国Merck公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 培养体系的构建包括过滤燃料、复活菌种和构建体系3步。

(1)过滤燃料。用0.22 μm滤膜过滤喷气燃料，除去喷气燃料中的微生物，并将过滤后的喷气燃料装至灭菌的1 L玻璃瓶中。

(2)复活菌种。在250 mL三角烧瓶中配制100 mL沙保氏液体培养基，并置于高压灭菌器中灭菌20 min(121 ℃)；在超净工作台中，将平板培养基中保存的不同菌种分别接种至沙保氏液体培养基中，封口膜封口后置于水浴恒温振荡器中培养3 天(30 ℃、170 rmin)，混合真菌菌液按枝孢霉菌、互隔交链孢菌、局限青霉、帚状曲霉、球毛壳菌按体积比7∶6∶5∶3∶1配制，并置于洁净的4 ℃冰箱中待用。

(3)构建体系。在超净工作台内，分别将700 mL 经0.22 μm滤膜过滤的3号喷气燃料和200 mL灭菌的Bushnell Haas培养基(简称BH培养基，配方为0.2 g硫酸镁、0.026 5 g二水氯化钙、1 g磷酸二氢钾、1 g磷酸氢二铵、1 g硝酸钾、0.083 g六水三氯化铁溶入1 L去离子水中)加入灭菌的1 L广口试剂瓶中，构建适宜微生物生长的培养体系；在培养体系中加入1 mL震荡培养3天(30 ℃、170 rmin)的菌液，然后置于30 ℃水浴中培养，分别于非检测日的上午、下午和晚上将广口瓶放置于敞开式摇床震荡15 min(170 rmin)，并定期检测相关指标。设置空白培养体系(喷气燃料和培养基体系)，并定期检测相关指标。从培养体系中加入菌液开始按第1天计。

1.2.2 培养体系外观试验过程中，每天在室温、自然光线下观察培养体系外观情况，目测喷气燃料及培养基的颜色变化、培养基和燃料界面现象变化、燃料相透明度变化、培养基是否有沉淀产生，并在取样时判断培养基和喷气燃料气味变化，判断特征真菌生长繁殖情况和对喷气燃料外观的影响。

1.2.3 水相、油相表面张力试验过程中，从第1天开始，每隔3天分别在油水界面上方和下方1～2 cm处各取30 mL喷气燃料和20 mL培养基，按照GBT 22237—2008《表面活性剂 表面张力的测定》要求，采用吊环法分别检测喷气燃料和培养基表面张力，每次各测试3次，取平均值。

1.2.4 喷气燃料总酸值试验过程中，从第1天开始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm处取30 mL喷气燃料油样，按照GBT 12574—1990《喷气燃料总酸值测定法》，将喷气燃料溶解于滴定溶剂中，以对-萘苯酚溶液作指示剂，用标定好的氢氧化钾异丙醇标准溶液进行滴定，检测喷气燃料总酸值。

1.2.5 喷气燃料水反应试验试验过程中，从第1天开始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm处取喷气燃料油样，根据GBT 1793—2008《航空燃料水反应试验法》规定，按磷酸盐缓冲溶液与喷气燃料按体积比1∶4的比例取样进行水反应试验，以水相体积变化、油水分离程度和油水界面现象反映喷气燃料中表面活性物质变化情况。

1.2.6 喷气燃料银片腐蚀试验过程中，从第1天开始，每隔3天在油水界面上方1～2 cm处取喷气燃料油样，按照SHT 0023—1990《喷气燃料银片腐蚀实验法》规定进行银片腐蚀试验，检测微生物生长繁殖过程中产生的活性硫化物。

1.2.7 喷气燃料ATP含量测定试验过程中，从第1天开始，每隔3天分别在油水界面上方和下方1～2 cm处各取50 mL喷气燃料和10 mL培养基，按照下述方法检测喷气燃料和培养基中的ATP含量，分别监控特征真菌在喷气燃料和培养基中的生长情况。

(1)喷气燃料ATP含量测定步骤如下：①取50 mL喷气燃料至灭菌的100 mL高密度聚乙烯(HDPE)瓶中，并加入1 000 μL提取液，摇晃30 s，静置5 min，然后用移液枪将蓝色提取液移至5 mL离心管中。②用移液枪取500 μL提取液至另一个5 mL离心管中，并加入500 μL裂解液，盖上盖子，摇晃30 s，使裂解液和培养基充分混合。③用移液枪取50 μL裂解液和提取液的混合液至拭子管中，加入400 μL酶液，震荡20 s，使提取液、裂解液混合液与酶液充分混合，然后将拭子管放入ATP检测仪测试，每次测试3次，取平均值。

(2)培养基ATP含量测步定骤如下：①测试时，先用移液枪吸管取500 μL培养基至5 mL离心管中，再用移液枪取500 μL裂解液至离心管中与培养基混合，盖上离心管盖子后上下颠倒摇晃30 s，使裂解液和培养基充分混合。②用移液枪从离心管中取50 μL培养基和裂解液混合液至拭子管中，往拭子管中加入400 μL酶液，震荡20 s，使培养基、裂解液混合液与酶液充分混合，然后将拭子管放入ATP检测仪测试，每次测试3次，取平均值。

2 结果与讨论

2.1 微生物对体系外观的影响

外观特性是检查喷气燃料质量最直观的方法，是国家标准GB 6537—2018《3号喷气燃料》规定的第一个检查项目，也是ASTM D6469—2014《燃料和燃料系统中微生物污染标准指南》规定的第一个检查项目。GB 6537要求，合格的喷气燃料在室温下应清澈透明，目视无不溶解水和固体物质；ASTM D6469认为，一旦在燃料和水之间存在第三相，或在任何一相中存在棕红色至黑色物质，或底部有大量沉淀，或底部样(油水界面上方5 cm内)颜色、透明度等指标与上部样不同，则表明燃料系统中可能有大量微生物。试验过程中，混合菌培养体系外观变化如图1所示。

图1 混合菌培养体系外观变化

由图1可知：试验开始时喷气燃料和培养基均清澈透明，油水界面清晰可见，界面处没有乳化物、带状物或泡沫；随着真菌的生长繁殖，两者不仅颜色逐渐变暗，尤其是培养基颜色变化更为明显，而且油水界面处逐渐出现乳化物，从第7天起界面处局部出现块状泡沫，并且泡沫逐渐变大；在第22天时泡沫将油水界面完全覆盖，并且界面处泡沫还向喷气燃料和培养基中延伸生长。此时喷气燃料已不符合GB 6537《3号喷气燃料》对喷气燃料外观的要求。真菌在喷气燃料中生长繁殖，不仅会影响喷气燃料外观，而且生成的泡沫和乳化物还可能会在使用中引起过滤器堵塞、计量系统失效等问题，影响喷气燃料的正常供给。

2.2 微生物对两相表面张力的影响

表面张力虽不是GB 6537—2018《3号喷气燃料》要求的喷气燃料检测项目，但表面张力的变化能够反映真菌生长繁殖过程中生成生物表面活性物质的多少。ASTM D6469—2014《燃料和燃料系统中微生物污染的标准指南》规定，应定期检测储罐底部水和近底部喷气燃料表面张力，确定各自表面张力的变化，可以反映出蛋白质、脂肪酸等生物表面活性物质的变化，从而间接反映微生物生长情况。

随着微生物的生长繁殖，培养基和喷气燃料表面张力变化情况如图2所示。由图2可知，培养基和喷气燃料表面张力均随培养时间的延长总体呈下降趋势，与初始喷气燃料和培养基表面张力相比，混合菌培养体系中喷气燃料表面张力下降了1.74%，培养基表面张力下降了16.17%，培养基表面张力较喷气燃料表面张力下降更为明显。

图2 喷气燃料和培养体系表面张力变化曲线

引起培养基和喷气燃料表面张力下降的原因，可能是真菌在代谢过程中产生的生物表面活性物质引起的。以烃类为碳源生长的微生物在生长代谢过程中会产生一些具有表面活性的两性物质，如糖类、多糖脂、脂肽等，这是微生物摄取烃类的机理决定的[7-8]。

2.3 微生物对喷气燃料总酸值的影响

总酸值是反应喷气燃料中酸性物质(主要指高分子有机酸)总含量的指标，在一定程度上能够表示对油料储运设备和用油装备的腐蚀性，其变化从宏观上反应了喷气燃料化学组成的变化。该指标对喷气燃料质量控制和储存管理具有重要意义，也是GB 65373—2018和ASTM D6469—2014规定的重要检测项目。

试验过程中，喷气燃料总酸值的变化情况如图3所示。由图3可知，在试验过程中混合菌培养体系喷气燃料总酸值呈明显增加趋势，且在第22 天时达到0.015 14 mgKOHg，已超出GB 6537《3号喷气燃料》规定的0.015 mgKOHg，特征真菌的协同效应加快了其对喷气燃料的影响。试验过程中，空白体系(BH培养基、喷气燃料)中喷气燃料总酸值变化不大，均未超出GB 6537规定的0.015 mgKOHg。

图3 喷气燃料总酸值变化曲线

喷气燃料总酸值的增加，可能是真菌在以喷气燃料为碳源进行生长繁殖过程中将烃类氧化生成的有机酸引起的。Varjani和牛明明等[9-10]认为，微生物氧化烷烃的途径有末端氧化和亚末端氧化两种。末端氧化指烷烃在加氧酶的作用下会被微生物氧化生成伯醇，然后在脱氢酶的作用下伯醇被氧化生成伯醛，醛在脱氢酶的作用下会被氧化成羧酸；亚末端氧化指烷烃先被氧化成仲醇，再被氧化成酮。芳香族化合物虽然较烷烃难以降解，但是在酶的作用下也能被微生物依次氧化成酚和羧酸。微生物氧化烃类生成的大分子羧酸能够进入喷气燃料中，增加喷气燃料酸值，增大燃料的腐蚀性，影响燃料储运系统和用油装备的安全和使用寿命。

2.4 微生物对培养基pH的影响

水相pH检测虽不是国家标准GB 6537—2018《3号喷气燃料》要求的喷气燃料检测项目，但在喷气燃料日常储存管理过程中要求及时排放水分，也不允许油罐底部长期有水层存在，培养体系中水相pH在一定程度上能够反映真菌在生长繁殖过程中生成酸性物质的量及其对喷气燃料使用性能的影响，能够预测对用油设备可能造成的危害。因此ASTM D6469—2014《燃料和燃料系统中微生物污染的标准指南》将水相pH作为一个重要的必检项目。

试验过程中，培养基pH变化如图4所示。由图4可知，培养基pH随时间的延长总体呈下降趋势，pH下降过程中出现小幅度波动，培养基pH前期下降较快，后期稳定。结合图3可知，真菌在以喷气燃料为唯一碳源进行生长繁殖过程中，可能将烃类氧化成了酸性物质，其中大分子有机酸进入油相，增加了喷气燃料总酸值，小分子酸性物质进入水相，降低了培养基pH。不管是溶于喷气燃料的大分子有机酸，还是溶于水相中的小分子有机酸，均会增加对燃料储运设施和用油装备的腐蚀。

图4 培养基pH变化曲线

2.5 微生物对喷气燃料水反应试验的影响

表面活性物质是喷气燃料洁净性指标，也是影响喷气燃料水反应试验的主要因素。表1为试验过程中混合菌培养体系喷气燃料水反应试验结果。结果表明，试验过程中真菌代谢繁殖产生的表面活性物质虽能显著降低喷气燃料的表面张力，但还不足以影响到水反应试验。真菌在生长过程中长期积累的表面活性物质对喷气燃料水反应试验有潜在影响，因此微生物对喷气燃料水反应试验的影响需要引起一定关注。

表1 喷气燃料水反应试验结果

2.6 微生物对喷气燃料银片腐蚀试验的影响

相比铜片腐蚀试验，银片对油品的腐蚀性物质更加敏感。腐蚀试验的目的是定性判断石油产品中是否存在腐蚀性物质，如活性硫化物(元素硫、硫化氢或硫醇)，特征真菌对喷气燃料银片腐蚀的影响见表2。由表2可知，银片腐蚀试验过程中，银片表面未出现明显变化，始终保持为0级，因此未进行铜片腐蚀试验。对喷气燃料腐蚀试验产生影响的主要是活性硫化物。试验过程中，特征真菌对银片腐蚀试验没有影响，可能是因为特征真菌在生长繁殖过程中不能将非活性硫化物(如培养基中的硫酸镁等)转化为活性硫化物。但有报道表明，喷气燃料中的硫酸盐还原菌会引起喷气燃料银片腐蚀不合格[11-12]。因此，喷气燃料出现微生物污染时，银片腐蚀也是需要重点关注的指标。

表2 喷气燃料银片腐蚀试验结果(50 ℃)

2.7 培养基和喷气燃料ATP含量

培养体系中，喷气燃料和培养基ATP含量变化曲线分别如图5和图6所示。

图5 喷气燃料ATP含量变化曲线

图6 培养基ATP含量变化曲线

由图5可知，随着培养时间增长，喷气燃料中微生物含量先下降，然后保持相对平稳，再快速上升。培养初期微生物含量下降，可能是由于接种初期特征真菌处于迟缓期，体系中缺乏足够的酶等中间产物，真菌生长缓慢，总数量有所下降；随着培养时间的增加，喷气燃料中ATP含量在一定时间的稳定后开始快速增加，对喷气燃料性质的影响也逐渐明显，在第22 天时ATP含量达到5 533.4 RLUL，比试验开始时增加了80.44%，此时喷气燃料总酸值达到了0.015 14 mgKOHg，超出了GB 6537规定的0.015 mgKOHg。

由图6可知，培养基中微生物含量在接入培养体系初期很高，然后经历短暂下降后再次上升。试验初期，培养基中微生物含量高，而喷气燃料中微生物含量迅速下降，说明试验初期微生物主要在培养基中生长繁殖；之后由于缺乏足够的酶等中间产物，两相中的微生物含量均保持较低水平；进入对数期后，微生物在两相中同时快速繁殖，这可能是因为此时微生物已产生大量表面活性物质，引起两相表面张力下降，增大了油在水中的溶解度和水在油中的溶解度，使两相均具备微生物生长的条件。

结合图3和图5可知：喷气燃料中ATP含量达到2 500 RLUL(13～16 d)之前，真菌含量变化较为平稳，增加比较缓慢，但是在ATP含量达到2 500 RLUL后真菌生长加速，喷气燃料中真菌含量快速增加；喷气燃料中ATP含量低于5 533.4 RLUL时，虽然真菌对喷气燃料总酸值有一定的影响，但总酸值一直处于标准允许的范围内，喷气燃料质量依然合格，当ATP含量达到5 533.4 RLUL时，总酸值超出规定范围，喷气燃料质量不再合格。

3 结 论

(1)特征真菌在生长繁殖过程中，会使底部喷气燃料颜色变暗，并产生乳化物，引起底部喷气燃料外观不符合标准要求；会产生表面活性物质，使喷气燃料和培养基表面张力下降，但在试验周期内对喷气燃料水反应试验无显著影响；会产生酸性物质，使喷气燃料总酸值显著上升，甚至出现酸值指标不合格的情况，但在试验周期内对银片腐蚀试验无显著影响。