中国南海海绵Aaptos suberitoides的化学成分

贺倩倩 苗 双 黄莹洁 李 敏 满玉清 宫凯凯

1 滨州医学院药学院 山东 烟台 264003；2 滨州医学院附属医院肿瘤研究实验室 山东 滨州 256603；3 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603；4 滨州医学院附属医院疼痛科 山东 滨州 256603

海洋来源的次级代谢产物多具有多样性的化学结构和显著的生物活性，是药物开发的重要源泉。截止到2018年，大约有28 600个新化合物从海洋中分离得到，其中海绵来源的大约占30%[1-2]。海绵来源的先导化合物多具有很好的成药前景，目前在被FDA批准的12个海洋药物中，海绵占据了3个，分别为治疗白血病的阿糖胞苷[3]、抗病毒的阿糖腺苷和抗肿瘤的甲磺酸艾日布林[4]。除此之外，海绵来源的衍生物Gemcitabine[5]、Discodermolide[6]、Hemiasterlin7[7]、PM0601848[8]也已进入临床研究。Aaptos属海绵属于寻常海绵纲(Demospongiae)，韧海绵目(Hadromerida)，皮海绵科(Suberitidae)，已鉴定大约20种[9]。1982年Nakamura等[10]首次对该属进行化学成分的研究，到目前，从该属中共分离得到62个化合物，其中Aaptamine类化合物47个，为该属海绵的特征性成分[11]。Aaptamine类化合物不仅具有多样性的结构，还具有良好的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗附着、酶抑制等活性[11]。刘彩霞等[12]从海绵Aaptossuberitoides中分离得到一系列具有显著抗肿瘤活性的Aaptamine二聚体类新骨架化合物。本研究对采自中国南海西沙群岛的海绵Aaptossuberitoides进行了初步的化学成分研究。

1 材料与方法

1.1 仪器试剂 Q-Tof-Ultima-Global型质谱仪(美国waters 公司)；DRX-500型核磁共振仪(美国Bruker公司)；Agilent高效液相色谱仪(美国Agilent 公司)；旋转蒸发仪(日本东京理化公司)；ZF-7型暗箱三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；BSZ-100自动馏分收集器(上海青浦沪西电子厂)；薄层硅胶GF254和柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)；柱层析用ODS(北京金欧亚科技发展有限公司)；SephadexLH-20(GE Healthcare，GE公司)；常用有机试剂(甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯等)均为国产分析纯；半制备HPLC用色谱纯甲醇或色谱纯乙腈。

1.2 生物材料 海绵Aaptossuberitoides于2012年10月采自于中国西沙群岛海域，其种名由荷兰自然生物多样性中心Leenvan Ofwegen 教授鉴定。样品标本(乙醇浸泡)保存在中国海洋大学医药学院天然药物化学一室，样品编号XS-2012-30。

1.3 提取分离 将-20℃冷冻保存的海绵样品(湿重5.75 Kg)用粉碎机粉碎后，室温下用甲醇动态冷浸提取5次，每次浸泡5 d；合并5次提取液，40℃下减压浓缩，然后用无水甲醇溶解脱盐3次，得总浸膏346 g。浸膏经减压硅胶柱层析(拌样硅胶100～200目，柱子填料硅胶300～400目)，石油醚/乙酸乙酯(100∶1～1∶4)、二氯甲烷/甲醇(20∶1～0∶1)梯度洗脱，分为7个粗组分(Fr.1～Fr.7)。

组分Fr.6(二氯甲烷/甲醇 10∶1)经硅胶柱不同比例二氯甲烷/甲醇(40∶1、20∶1、10∶1、5∶1、1∶1)、纯甲醇洗脱得到7个组分(Fr.6-1～Fr.6-7)。组分Fr.6-1(二氯甲烷/甲醇 40∶1)经ODS柱甲醇(40%～100%)梯度洗脱得到5个组分(Fr.6-1-1～Fr.6-1-5)，组分Fr.6-1-4(甲醇/水 40∶60)通过液相制备(乙腈/水 20∶80 v/v，流速为1.0 mL/min，C18柱)可得化合物1(6.05 mg，t=9.8 min)；组分Fr.6-4(二氯甲烷/甲醇 40∶1，20∶1)经ODS柱甲醇(10%～100%)梯度洗脱得到5个组分(Fr.6-4-1～6-4-6)，组分Fr.6-4-3(甲醇/水10∶90)通过液相制备(乙腈/水 15∶85v/v，流速为1.0 mL/min，C18柱)制备可得化合物2(18.59 mg，t=5.3 min)。组分Fr.5(二氯甲烷/甲醇 20∶1)经ODS柱甲醇(20%～60%)梯度洗脱得到6个组分(Fr.5-1～ Fr.5-6)：组分Fr.5-1(甲醇/水 20∶80)通过液相制备(甲醇/水 10∶90v/v，流速为1.5 mL/min，C18柱)制备可得化合物3(12.41 mg，t=11.3 min)，4(14.64 mg，t=18.5 min)，5(16.68 mg，t=16.6 min)，6(11.40 mg，t=24.2 min)，7(33.59 mg，t=35.9 min)。

2 结构鉴定

本研究从其甲醇提取物中共分离了7个单体化合物，应用各种波谱技术结合文献数据对比，鉴定为3-(methylamino)demethyl(oxy)aaptamnie(化合物1)、aaptamine(化合物2)、尿嘧啶(化合物3)、胸腺嘧啶(化合物4)、cyclo(Pro-Ser)(化合物5)、cyclo(Pro-Thr)(化合物6)、胸腺嘧啶脱氧核苷(化合物7)。化合物aaptamine、环(脯-丝)二肽[cyclo(Pro-Ser)]、环(脯-苏)二肽[cyclo(Pro-Thr)]为首次从本属海绵中分离得到。7个化合物的结构式见图1。

图1 化合物1～7的结构式

化合物1分子式为C13H11N3O2，桔黄色粉末，10%H2SO4/EtOH显粉色；ESI/MS：242[M+H]+；1H NMR(500MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 8.87(1H, d,J=4.4 Hz, H-5), 8.46(1H, q,J=5.0 Hz, NH-1′), 8.32(1H, s, H-2), 7.77(1H, d,J=4.5 Hz, H-6), 7.04(1H, s, H-7), 3.87(3H, s, OMe-8), 3.11(3H, d, J=5.2 Hz, NMe-2′);13C NMR(600MHz, DMSO, TMS, δ), δC: 174.4(C-9), 157.3(C-8), 150.6(C-5), 145.0(C-3), 135.5(C-6a), 135.3(C-3a), 133.0(C-9a), 129.6(C-2), 122.2(C-6), 117.4(C-9b), 106.8(C-7), 55.8(OMe-8), 29.2(NCH3-2′)。以上核磁氢谱和碳谱数据均与文献[13]报道一致，鉴定为3-(methylamino)demethyl(oxy)aaptamine。

化合物2分子式为C13H12N2O2，黄色胶状，10%H2SO4/EtOH显黄色;ESI/MS：229[M+H]+；1H NMR(500MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 12.7((1H, s, NH-1), 7.83(d,J=7.1 Hz, 1H, H-2), 7.37(d,J=7.1 Hz, 1H，H-5), 7.09(1H, s, H-7), 6.85(d,J=7.2 Hz, 1H, H-6), 6.50(d,J=7.0 Hz, 1H, H-3), 3.97(3H, s, OMe-8), 3.80(3H, s, OMe-9);δC: 156.8(C-8), 149.7(C-3a), 141.8(C-2), 133.7(C-9a), 132.6(C-6a), 131.3(C-9), 129.9(C-5), 116.3(C-9b), 112.5(C-6), 100.7(C-7), 98.1(C-3), 60.4(OMe-9), 56.4(OMe-8)。以上核磁氢谱和碳谱数据均与文献[10]报道一致，鉴定为aaptamine。

化合物3分子式为C4H4N2O2,淡黄色固体，10%H2SO4/EtOH显灰色；ESI/MS：113[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 10.45(1H, s, H-1), 10.45(1H, s, H-3), 7.38(1H, d,J=7.4 Hz, H-6), 5.43(1H, d,J=7.4 Hz, H-5);δC: 164.4(C-4), 151.6(C-2), 142.3(C-6), 100.2(C-5)。以上核磁氢谱和碳谱数据均与文献[14]报道一致，鉴定为尿嘧啶。

化合物4分子式为C5H6N2O2,无色油状物，10%H2SO4/EtOH显灰色；ESI/MS：127[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 10.88(1H, s, H-1), 10.88(1H, s, H-3), 7.25(1H, s, H-6), 1.72(1H, s, CH3-5);δC: 164.9(C-4), 151.5(C-2), 137.8(C-6), 107.6(C-5), 11.8(CH3-5)。上述核磁数据与文献[15]报道一致，鉴定为胸腺嘧啶。

化合物5分子式为C8H12N2O3,黄色油状物，10%H2SO4/EtOH显灰色；ESI/MS：185[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δH 7.88(1H, s, H-4), 4.86(1H, m, OH), 4.11-4.15(1H, m, H-3), 4.00-4.03(1H, m, H-10a), 3.66-3.74(2H, m, H-6, 10b), 3.40-3.46(m, 1H, H-9a), 3.32(overlapped, 1H, H-9b),2.11-2.17(1H, m, H-7b), 1.76-1.88(3H, m, H-7a, 8), 1.21(3H, d,J=6.5 Hz, H-11);δC: 169.1(C-2), 164.9(C-5), 59.9(C-10), 58.4(C-3), 56.8(C-6), 44.6(C-9), 27.9(C-7), 21.9(C-8)。上述核磁数据与文献[16]报道一致，鉴定为环(脯-丝)二肽[cyclo(Pro-Ser)]。

化合物6分子式为C9H14N2O3,黄色油状物，ESI/MS：199[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δH 7.64(1H, s, H-4), 4.81(1H, m, H-10), 4.03-4.21(2H, m, H-3, 6), 3.84(1H, m, H-9b), 3.40-3.51(m, 1H, H-9a), 2.03-2.24(1H, m, H-7b), 1.59-1.99(3H, m, H-7a, 8), 1.21(3H, d,J=6.5 Hz, H-11);δC 169.1(C-2), 164.9(C-5), 64.6(C-10), 59.6(C-6), 58.3(C-3), 44.6(C-9), 27.9(C-7), 21.9(C-8), 20.2(C-11)。上述核磁数据与文献[17-18]报道一致，鉴定为环(脯-苏)二肽[cyclo(Pro-Thr)]。

化合物7分子式为C10H14N2O5,白色晶体，10%H2SO4/EtOH显灰色；ESI/MS：243[M+H]+；1H NMR(500 MHz, DMSO, TMS,δ),δH: 7.70(1H, s, H-6), 6.16(1H, dd,J=7.6, 6.2 Hz, H-1′), 4.23(1H, m, H-3′), 3.75(1H, d,J=3.2 Hz, H-4′), 3.55(2H, dd,J=11.8, 24.7 Hz, H-5′), 2.05(2H, m, H-2′), 1.77(3H, s, CH3-5);δC: 163.8(C-4), 150.5(C-2), 136.2(C-6), 109.4(C-5), 87.3(C-4′), 83.8(C-1′), 70.4(C-3’), 61.3(C-5′), 39.3(C-2′), 12.3(CH3-5)。上述氢谱数据与文献[19]报道一致，确定为脱氧胸腺嘧啶核苷。

3 讨论

本研究对海绵Aaptossuberitoides进行了初步的化学成分研究，从中分离得到7个单体化合物，其中aaptamine生物碱类化合物2个，嘧啶类化合物2个，环二肽类化合物2个，腺苷类化合物1个。Aaptamine类化合物是具有苯并1,6-萘啶骨架的一类海洋海绵特征性生物碱。结构上具有多样性取代、二聚、重排、以及扩环等主要特征[20]。其具有良好的抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化等活性[21]，这表明Aaptos属海绵作为生物活性物质的来源，具有进一步研究和开发的价值。典型的环二肽类化合物种类繁多且来源广泛，大约90%来自于革兰氏阴性菌，但在真菌、植物和动物中都有分布。环二肽通过两个氨基酸酰胺内环化而成，母体为2,5-二酮哌嗪或2,5-二氧哌嗪，是已知最小的结构最简单的肽类衍生物[22]。该类化合物具有多种多样的生物活性如抗肿瘤、抗毒素、镇痛、抑菌等[23]，但至今未开发成为药物。核苷是由糖基和碱基通过共价键连接组成的化合物，碱基包括嘌呤、嘧啶和修饰碱基(大部分是嘌呤和嘧啶的甲基化产物)。核苷类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、基因治疗等多种生物活性，目前临床上使用的抗肿瘤药物阿糖胞苷和近50%的抗病毒药物属于核苷类化合物[24]。

综上所述，本研究分离得到的7个化合物含有aaptamine类、嘧啶类、核苷类、环二肽类四种结构类型，初步揭示了海绵Aaptossuberitoides化学多样性，化合物aaptamine、环(脯-丝)二肽[cyclo(Pro-Ser)]、环(脯-苏)二肽[cyclo(Pro-Thr)]首次从Aaptos属海绵中分离得到，丰富了该属海绵的化学结构类型。