乳腺原发癌和淋巴结转移癌中ALDH1A1和TGF-β1的表达及预后价值

宋婷婷 张会芳 韩玉贞

滨州医学院附属医院病理科 山东 滨州 256603

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，非特殊型浸润性癌是最常见的组织学类型。对于淋巴结转移的乳腺癌，尽管其术后行内分泌治疗、分子靶向治疗和放化疗等综合治疗，但有些预后仍较差。乙醛脱氢酶1(aldehyde dehydrogenases 1，ALDH1)是乳腺癌干细胞的特异性标志物，其高表达与乳腺癌预后不良有关[1-2]。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)中起诱导作用，乳腺癌EMT的发生使转化细胞具有乳腺癌干细胞的特性[3]。TGF-β1的表达与乳腺癌的恶性进展及不良预后有关[4]。有关ALDH1和TGF-β1的研究大多集中于乳腺原发癌，然而由于肿瘤基因的变异和肿瘤进展，乳腺转移癌中ALDH1和TGF-β1的表达与原发癌相比，可能存在差异。本研究拟探讨ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原发癌和相应淋巴结转移癌中的表达情况及对判断预后的价值。

1 材料与方法

1.1 临床资料 收集我院病理科2011年1月至2016年12月间行乳腺癌改良根治术的病例，纳入随访资料完备的197例伴有淋巴结转移的非特殊型浸润性乳腺癌患者作为研究对象。所有患者均为女性，术前均未接受新辅助治疗，入选病例随访至2020年6月，中位随访期为47个月。

1.2 抗体与试剂 ALDH1A1兔抗人单克隆抗体(bs-10162R)、TGF-β1兔抗人单克隆抗体(bs-0103R)及SP免疫化学试剂盒(SP-0023)均购于博奥森公司，DAB显色试剂盒、免疫组化抗原修复液均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色 10%中性福尔马林溶液固定的石蜡标本按3 μm连续切片，将载玻片放置64℃烤箱中烘烤1 h，再进行二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，自来水冲洗，PBS缓冲液冲洗，高温高压抗原修复，PBS冲洗，3%H2O2孵育，PBS冲洗，滴加正常山羊血清工作液孵育，加入一抗(ALDH1A1浓度为1∶100、TGF-β1浓度为1∶200)后4℃过夜，放置37℃恒温箱中复温30 min，PBS冲洗，滴加山羊抗兔二抗孵育30 min，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育30 min，PBS冲洗后DAB显色，显微镜下控制显色时间并及时终止，苏木素复染，中性树胶封片。以PBS缓冲液代替一抗作为空白对照组，以已知阳性片作为阳性对照组。

1.4 结果判定 免疫组化结果判定参照Kawasaki等[5]报道的方法，从着色强度和着色范围两方面综合判定。着色强度评分：无色为0分；淡黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞比例评分:<5%为0分；5%～25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。两个结果相加计分，<2分为(-)；2～3分为(+)；4～5分为(++)；6～7分为(+++)。根据实验结果将0～3分定义为阴性，4～7分定义为阳性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0进行统计学分析，两个变量之间的相关性采用Spearman的相关分析法；应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线并用Log-rank检验做各组生存率比较；单因素和多因素分析采用Cox比例风险回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALDH1A1和TGF-β1的免疫组化结果 ALDH1A1和TGF-β1均表达于细胞浆，常呈现黄色至棕褐色颗粒(图1)。

A.ALDH1A1在原发癌中的阳性表达；B.ALDH1A1在淋巴结转移癌中的阳性表达；C.TGF-β1在原发癌中的阳性表达；D.TGF-β1在淋巴结转移癌中的阳性表达。

2.2 ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原发癌和相应淋巴结转移癌的表达 ALDH1A1和TGF-β1在原发癌和转移癌中均阳性和均阴性表达的一致率分别为87.82%(173/197)、86.80%(171/197)，ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原发癌和相应淋巴结转移癌之间均呈正相关(P<0.05)，见表1。

表1 乳腺原发癌与淋巴结转移癌中ALDH1A1与TGF-β1的表达

2.3 乳腺原发癌及淋巴结转移癌中ALDH1A1、TGF-β1的表达的生存分析Kaplan-Meier生存曲线分析显示，原发癌和淋巴结转移癌中ALDH1A1和TGF-β1阳性组的生存率均明显低于阴性组，P<0.05`，见图2。

A-B.ALDH1A1和TGF-β1不同表达的原发癌患者生存曲线比较；C-D.ALDH1A1和TGF-β1不同表达的淋巴结转移癌患者生存曲线比较。

2.4 乳腺癌临床病理特征的Cox比例风险回归模型分析Cox单因素分析显示，组织学分级(P<0.05)、肿块大小(P<0.05)、阳性淋巴结个数(P<0.001)、原发癌和转移癌中ALDH1A1的表达(P<0.001)和TGF-β1的表达(P<0.01)均是患者预后的危险因素。将统计学分析中有统计学意义的变量引入Cox模型进行多因素分析，结果显示，阳性淋巴结个数(P<0.01)、原发癌中ALDH1A1的表达(P<0.01)、转移癌中TGF-β1的表达(P<0.05)均为患者总生存率的独立危险因素，见表2。

表2 197例乳腺癌患者总生存期相关因素分析

2.5 乳腺原发癌和转移癌中ALDH1A1和TGF-β1的相关性分析Spearman相关性分析显示，在原发癌和淋巴结转移癌中ALDH1A1和TGF-β1表达均呈正相关(P<0.05)，见表3。

表3 乳腺原发癌及淋巴结转移癌中ALDH1A1与TGF-β1表达的相关性分析

3 讨论

2003年，Al-Hajj等[6]首先从乳腺癌细胞中分离出分子表型为CD44+CD24-的细胞群，其在免疫缺陷小鼠体内具有高致瘤性，首次提出了乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSCs)的概念。2007年，Ginestier等[7]证实约500个ALDH1阳性乳腺癌细胞即可在小鼠体内致瘤，随后研究发现在免疫缺陷小鼠体内致瘤所需的ALDH1阳性细胞比CD44+CD24-细胞所需的数量少，表明ALDH1能更好地用于乳腺癌干细胞的标记。ALDH1家族有三个亚型，分别为ALDH1A1、ALDH1A2和ALDH1A3，其中ALDH1A1活性最强，被研究最为广泛[8]。ALDH1A1基因敲除后可降低乳腺癌的转移和耐药[9-10]。乳腺癌中ALDH1的表达与患者不良预后有关[1-2,11]。对食管鳞状细胞癌[12]、肺腺癌[13]和卵巢癌[14]的研究亦显示ALDH1的表达与患者预后不良有关。本研究表明在197例乳腺原发癌中，ALDH1A1阳性表达与总生存率有关。原发癌中ALDH1A1为患者预后的独立危险因素。

TGF-β信号可通过诱导Snail/2、ZEBI/2、ET-1、OCT4和HMGA2等转录因子的表达从而促进EMT的发生，研究表明，在肿瘤初期，TGF-β作为肿瘤生长抑制因子抑制原位肿瘤分裂和增殖，促使细胞衰老和凋亡；而在肿瘤晚期，TGF-β则促进肿瘤浸润和转移[15]。miR-133b作为肿瘤抑制因子，通过直接靶向抑制转化生长因子受体(TGF-βR1)和抑制TGF-β/SMAD通路来阻断TGF-β对EMT的诱导及肿瘤的转移[16]。TGF-β高表达与乳腺癌不良预后有关[4,17]。本研究结果与以上研究结果一致，乳腺原发癌中TGF-β1的高表达与预后不良有关。

乳腺癌淋巴结转移是判断乳腺癌预后的重要指标。在乳腺原发癌和相应淋巴结转移癌中存在蛋白表达的差异。Zhao等[18]研究表明，乳腺原发癌中雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)的表达与相应淋巴结转移癌中的表达有一定差异，但具有一致性。Goicoechea等[19]研究表明，乳腺原发癌和淋巴结转移癌中G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1)的表达不一致，存在着异质性。Yoshioka等[20]分析发现ALDH1A1在原发灶和淋巴结转移灶中表达呈显著正相关。但有研究表明，乳腺淋巴结转移癌中ALDH1的表达与患者预后无关[21]。然而，有关ALDH1A1和TGF-β1在乳腺原发癌和相应淋巴结转移癌中的比较研究，国内外鲜有报道。本研究表明，ALDH1A1和TGF-β1的表达在乳腺原发癌和淋巴结转移癌中有一定的不一致性，但均具有明显的相关性，且淋巴结转移癌中ALDH1A1和TGF-β1的高表达均与预后不良有关。转移癌中TGF-β1为患者预后的独立危险因素。

TGF-β1可以通过PI3K/AKT信号通路促进乳腺癌细胞EMT[22]。EMT是肿瘤获取干细胞特性的途径[3]。TGF-β通路可调控乳腺肿瘤干细胞ALDH1亚群的表达[23]。本研究表明，不论在原发癌还是在淋巴结转移癌中ALDH1A1和TGF-β1均呈明显的正相关。因此，我们推测TGF-β1的高表达伴有ALDH1A1的高表达，可能是TGF-β1通路调节乳腺癌EMT的过程，进而调节ALDH1阳性乳腺癌干细胞的发生发展。