黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化应激损伤的保护作用

刘 慧 闫 冬 徐洋洋 李淑翠 张树平

1 滨州医学院基础医学院药理学教研室 山东 烟台 264003；2 滨州医学院附属医院药学部 山东 滨州 256603

氧化应激是引起神经损伤的原因之一，细胞内的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的产生和清除不平衡会引起ROS的过度积累，导致氧化应激。氧化应激会破坏蛋白质、酶、脂质等成分，损害神经元[1]。SH-SY5Y细胞源自人神经母细胞瘤SK-N-SH系，此细胞能够表达神经元所特有的酪氨酸羟化酶、多巴胺、多巴胺-β羟化酶和多巴胺转运体[2]，因此它常作为神经元细胞模型，用于神经系统疾病的发病及作用机制方面的研究[3]。H2O2能够引起组织细胞氧化损伤，破坏细胞膜的结构，导致组织细胞受损[4]。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)是调节氧化还原平衡的关键转录因子。氧化应激状态下，Nrf2被激活，并由细胞浆转移至细胞核，提高谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)和超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase，SOD)的活性，从而对抗氧化应激[5]。其下游蛋白血红素氧化酶1(Heme Oxygenase 1，HO-1)是一种重要的内源性抗氧化防御蛋白，可以催化血红素降解，具有抗氧化、维持细胞微循环和调节细胞周期的作用[6]。

从中药中提取出的多种活性单体化合物对神经元细胞发挥有益的作用。黄杞苷是中药土茯苓中一种具有生物活性的黄酮类化合物。中国药典记载，土茯苓性平，除湿、解毒、通利关节。土茯苓中含有的黄酮苷类物质包括黄杞苷、落新妇苷、白藜芦醇等[7]。Huang等[8]研究发现，黄杞苷通过调节果蝇肌动蛋白(kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1)/Nrf2通路的功能，减轻了Aβ1-42诱导的BV-2细胞氧化应激和炎症反应。本研究拟建立H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤模型，观察黄杞苷的抗氧化损伤作用，探讨其分子机制是否与Nrf2/HO-1信号通路有关。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要药物和试剂 人神经母细胞瘤细胞株(SH-SY5Y)，购买于中国医学科学院基础医学研究所。黄杞苷(标准品，HPLC≥98%)购自森贝伽生物科技(南京)有限公司；胎牛血清、DMEM培养基购于Gibco公司；Nrf2抗体(ab137550)、HO-1抗体(ab13243)、Lamin B1抗体(ab65986)和辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(ab6721)均购自Abcam公司(美国)；细胞核蛋白和细胞浆蛋白抽提试剂盒、4-甲基偶氮唑蓝(MTT)检测试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染试剂盒、DCFH-DA试剂盒、SOD活性检测试剂盒和GSH过氧化物酶检测试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司(中国，上海)。

1.2 仪器 HERAcell 240I CO2培养箱购自美国Thermo公司；LA2-5A1型生物安全柜购自新加坡ESCO公司；H1M全功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司；SYSTEM GelDoc XR+凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；Eppendorf低温高速离心机购自Eppendorf AG公司。

1.3 细胞培养 复苏并培养SH-SY5Y细胞，将其置于培养条件为10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内常规培养，每两天换一次培养液，每三天传代一次，细胞生长至约80%融合时进行相关实验。

1.4 H2O2损伤模型的建立 将细胞接种在96孔板中，分为空白对照组与H2O2损伤组，共6组，每组设置6个副孔，每孔含完全DMEM培养基200 μL，37 ℃、5%CO2条件下培养24 h，使细胞完全贴壁。小心去除培养基，向每孔中加入H2O2终浓度为(125、200、250、500和800 μmol·L-1)的不完全DMEM培养基溶液200 μL，继续培养12 h。弃掉含有H2O2的培养基，向每孔中加入100 μL的MTT工作液，培养箱中孵育4 h，弃掉MTT工作液，每孔加120 μL DMSO，490 nm下检测吸光度(OD值)，以空白对照组细胞的抑制率为0 %，根据各组细胞平均OD值计算各组细胞平均抑制率，用SPSS软件计算得到IC50值，最终确定H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h作为H2O2损伤模型的条件。

1.5 MTT法 SH-SY5Y细胞以每毫升4×104个接种于96孔板中，待细胞处于对数生长期时，分为空白对照组、模型组和给药组，6个给药组分别加入不同浓度黄杞苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)预处理12 h后，模型组和给药组给予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。采用MTT法检测SH-SY5Y细胞存活率。

1.6 检测SOD和GSH水平 SH-SY5Y细胞以每毫升4×104个接种于96孔板中，待细胞处于对数生长期时，分为空白对照组、模型组和给药组，3个给药组分别加入黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)预处理12 h后，模型组和给药组给予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。按照试剂盒说明的方法准备测定所需工作液，并对各组样品进行处理。总SOD活力以SOD活力单位表示，GSH含量以各组等量样品匀浆中GSH浓度表示。

其中总SOD活力计算公式为：

GSH计算公式为：

1.7 流式细胞术 将SH-SY5Y细胞按每孔5×105个细胞的密度接种在6孔板中培养24 h，使细胞完全贴壁。分为空白对照组、模型组和给药组，给药组分别加入黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)预处理12 h后给予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h，模型组和给药组只给予H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h。通过流式细胞术对使用DCFH-DA探针标记的SH-SY5Y细胞进行ROS水平测定。用不完全DMEM培养基将10 mmol·L-1的DCFH工作液以1∶1 000比例稀释为10 μmol·L-1的工作液，每管细胞中加入100 μL并置于培养箱中孵育20 min，离心弃上清，每管中加入4℃ PBS 100 μL吹打混匀，用流式细胞仪进行计数和荧光强度检测。

1.8 Western Blot 将SH-SY5Y细胞按每孔5×105个细胞的密度接种在6孔板中培养24 h，使细胞完全贴壁。一种实验设计是分对照组和实验组，黄杞苷(20 μmol·L-1)预处理6、12、24 h后，Western Blot检测各组细胞浆和细胞核内Nrf2的表达的影响。另一种实验设计是分对照组、模型组和给药组，给药组分别给予不同黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)预处理12 h后，模型组和给药组用H2O2(500 μmol·L-1)孵育12 h，Western Blot检测各组细胞浆和细胞核内Nrf2的表达以及细胞浆内HO-1的表达。

2 结果

2.1 MTT法检测细胞存活率

2.1.1 H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤浓度筛选 利用MTT法确定H2O2的损伤条件，计算各组细胞活力损失百分比和抑制率。根据MTT的活力计算IC50值，以损伤条件接近IC50与试剂配制简便为原则，最终确定H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤模型条件为500 μmol·L-1H2O2损伤12 h。

2.1.2 黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用 先用不同浓度黄杞苷(5、10、20、40、80、160 μmol·L-1)预处理SH-SY5Y细胞12 h，再用500 μmol·L-1H2O2孵育12 h，采用MTT法检测细胞活力。结果显示，与对照组相比，H2O2损伤细胞12 h后，细胞活力明显下降(P<0.01)，而黄杞苷处理过的细胞，其活力明显上升且呈现剂量依赖性趋势，并在20 μmol·L-1处呈现最佳促进浓度(P<0.01)，见图2。因此，在后续实验中选取5、10、20 μmol·L-1的黄杞苷作为预处理给药浓度。

和对照组相比，**P<0.01。

和对照组相比，##P<0.01；和模型组相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.2 黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤后SOD和GSH含量的影响 模型组H2O2孵育12 h后SH-SY5Y细胞的SOD和GSH水平显著降低(P<0.01)，黄杞苷(5，10和20 μmol·L-1)预处理后的SH-SY5Y细胞SOD和GSH水平较模型组显著升高(P<0.05)，如图3所示。结果表明，黄杞苷能够上调SH-SY5Y细胞中SOD和GSH水平，减轻H2O2对SH-SY5Y细胞的氧化损伤。

A.模型组平均SOD活力为0.53U，空白组为1.31U，低、中、高给药组活力分别为1.08U、1.09U、0.87U；B.模型组GSH的平均浓度为20.90 μmol·L-1，空白组为60.13 μmol·L-1，低、中、高给药组浓度分别为30.04、35、34 μmol·L-1。和对照组相比，##P<0.01；和模型组相比，*P<0.05,**P<0.01。

2.3 黄杞苷抑制H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤后ROS的生成 利用流式细胞术和DCFH-DA探针技术对SH-SY5Y细胞ROS的生成量进行检测，其散点图结果见图4A，对阳性细胞计数并统计，统计结果见图4B。结果表明，空白组细胞经DCFH-DA染色后ROS生成较少(4.07% ± 0.90)，H2O2孵育SH-SY5Y细胞12 h后，ROS阳性率(11.27±0.91)显著提高，P<0.01。黄杞苷给药组(5、10和20 μmol·L-1)剂量依赖性降低了ROS阳性率，三个浓度的阳性率分别为10.5±0.6，6.93±0.64，5.83±0.61。和模型组相比，黄杞苷给药组(10和20 μmol·L-1)ROS阳性率显著降低，P<0.01。结果表明，黄杞苷能够浓度依赖性地抑制H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤后ROS的生成增多。

和对照组相比，##P<0.01；和模型组相比，**P<0.01。

2.4 黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中Nrf2表达的影响 为了探讨黄杞苷抑制H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用机制，本研究采用Western blot方法分析了Nrf2的表达及其核转位情况。免疫印记结果显示，黄杞苷(20 μmol·L-1)孵育细胞0、6、12、24 h后，能够时间依赖性地促进细胞核内Nrf2蛋白表达(P<0.05)，且在12 h时最显著(图 5 A、B、C)。此外，黄杞苷(5，10和20 μmol·L-1)预处理12 h后，细胞核中的Nrf2表达量明显增加(P<0.01)，胞浆内Nrf2表达量减少(P<0.01)，说明黄杞苷可以浓度依赖性地激活Nrf2，并促进其向核内转位(图5 D、E、F)。

A.用黄杞苷(20 μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞进行不同时间(0、6、12和24 h)孵育处理，Western Blot检测分析核Nrf2与胞浆Nrf2表达水平，利用Image J软件对Western Blot条带进行灰度值分析；B.不同效应时间SH-SY5Y细胞核Nrf2表达统计结果；C.不同效应时间SH-SY5Y细胞胞浆Nrf2表达统计结果；D.用不同浓度黄杞苷(5、10和20μmol·L-1)处理细胞12 h，Western Blot检测分析核Nrf2与胞浆Nrf2表达水平，利用Image J软件对Western Blot条带进行灰度值分析；E.不同浓度黄杞苷处理后SH-SY5Y细胞核Nrf2表达统计结果；F.不同浓度黄杞苷处理后SH-SY5Y细胞胞浆Nrf2表达统计结果。和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；和模型组相比，#P<0.05，##P<0.05。

2.5 黄杞苷对H2O2诱导SH-SY5Y细胞损伤中HO-1表达的影响 黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)预处理SH-SY5Y细胞12 h后，H2O2孵育12 h。Western Blot检测HO-1蛋白表达情况见图6A，HO-1蛋白统计结果见图6B，与模型组比较，黄杞苷低、中剂量组HO-1水平显著提高(P<0.01)，而高剂量组HO-1表达略有升高。这说明，黄杞苷在一定程度上能够促进HO-1蛋白的表达，降低H2O2诱导SH-SY5Y细胞氧化损伤。

A.不同浓度黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)处理细胞12 h后，Western Blot 法检测分析细胞总蛋白中HO-1的表达情况；B.不同浓度黄杞苷处理后HO-1蛋白表达统计结果。和模型组相比，**P<0.01。

3 讨论

氧化应激是诸多中枢神经系统疾病的重要病理机制，主要表现为活性氧的增加和抗氧化能力的下降，过量的活性氧导致细胞膜发生脂质过氧化、蛋白质的降解以及核酸的破坏，严重影响神经元突触功能，甚至导致神经元凋亡[9]。因此，氧化应激成为预防和治疗中枢神经系统疾病的重要靶标。SOD是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，可反映机体对氧自由基的清除能力，具有高度专一性，SOD活性水平降低与神经组织受损直接相关[10]。GSH-Px是谷胱甘肽系统中一种重要的酶，它能调节细胞氧化还原平衡，在降低H2O2或氧化型脂质的水平中起到重要作用[11]。本研究表明，H2O2诱导SH-SY5Y细胞12 h后ROS阳性率显著提高、SOD、GSH-Px含量显著降低。黄杞苷(5、10和20 μmol·L-1)预处理后，黄杞苷剂量依赖性地降低H2O2诱导SH-SY5Y损伤后ROS阳性率、提高SOD、GSH-Px含量。

Nrf2是存在于细胞质中的重要的氧化应激调控蛋白。正常状态下，机体内存在Nrf2分子合成和酶解的动态平衡，Nrf2分子与Keap1结合形成异二聚体，并借助Keap1蛋白固定在细胞骨架上[12]。氧化应激反应发生时，大量ROS可促使Nrf2从Keap1上解离，并转移至细胞核内，并与核内抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)结合将其激活，从而使机体上调下游一些抗氧化因子相关基因的表达[13]，HO-1相关基因就是ARE下游靶基因之一[14]。本次研究中，模型组Nrf2表达略有上升，可能是氧化应激引起机体自身抗氧化防御系统启动。与模型组相比，黄杞苷显著促进Nrf2从胞浆向细胞核内的转移，且呈现剂量依赖性趋势。此外，对黄杞苷预处理SH-SY5Y细胞的药动学结果看，Nrf2在12 h时出现最大转移，表明黄杞苷对Nrf2的最佳效应时间比较接近12 h。与模型组相比，黄杞苷给药组HO-1表达显著提高，结合Nrf2结果可知，黄杞苷可通过增加Nrf2向核内转移，进而激活下游HO-1蛋白，发挥其保护作用。

综上所述，本文首次研究了黄杞苷对H2O2诱导的SH-SY5Y氧化应激损伤的保护作用，其机制可能是激活了Nrf2，并促进Nrf2向核内转位，进而上调了其下游抗氧化酶HO-1的表达。但是，黄杞苷对Nrf2由胞浆向核膜的转移是否同时激活了Nrf2上游通路蛋白，尚需进一步研究。