植物乳酸菌和贮藏温度对辣木叶青贮品质的影响

吕竑建 ，郭香 ，陈德奎 ，陈晓阳 *，张庆 *

（1. 华南农业大学动物科学学院，广东广州510642；2. 华南农业大学林学与风景园林学院，广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东广州510642）

辣木（Moringa oleifera）起源于喜马拉雅，现广泛种植于世界各地。辣木不仅可以适应多种环境，且能在较恶劣的环境下生长，年均生物量可以达到43～115 t·hm-2［1］。辣木作为功能性食品和饲料，不仅富含多种必需氨基酸，同时有高含量的维生素A、B、C 和E，更有黄酮和多酚类生物活性物质，能对动物健康产生积极影响［2］。不仅如此，辣木含有较高含量的粗蛋白和较低的纤维含量，使辣木可以开发成高质量的植物性蛋白质饲料［1，3］。近年来，有很多研究表明，在饲料中添加辣木可以提高动物生产性能或改善动物健康。Kholif 等［4］发现用辣木替代部分苜蓿（Medicago sativa），可以提高哺乳期山羊的饲料消化率和产奶量，改善瘤胃发酵。Sebola 等［5］报道在肉鸡饲料中添加辣木叶粉可以提高肉鸡生长性能和胴体品质。Babiker 等［6］报道辣木叶可以作为饲料蛋白源补充和提高生长期的绵羊和山羊的生长性能。此外，用辣木粉替代豆粕可以减少CH4的产生，以减少温室气体的排放［7］。然而，这些报道多为辣木叶粉的使用，较少出现辣木叶青贮的研究。辣木叶粉的制作增添了工序，且由于南方天气常潮湿闷热，不易于保存，辣木叶粉容易出现霉变。青贮的制作工艺简便，直接使用原料制作大大降低了难度，且封装后受环境因素影响小，还能降低植物性饲料中的抗营养因子［8］。众所周知，乳酸菌在青贮发酵中具有极其重要的意义，青贮发酵质量往往受青贮中乳酸菌数量和活性影响。乳酸菌作为一种发酵促进剂，能够促进青贮初期尽快进入乳酸发酵阶段，促进单糖物质转化为乳酸，使pH 迅速降低，同时抑制蛋白质的水解作用，降低氨态氮，减少酵母菌和霉菌的滋生［9］。乳酸菌添加剂的有效性常被某些环境因素影响，环境温度就是一个重要影响因素，同时发酵品质也受环境温度影响［10］。

由于中国南方常年高温湿热的天气，对青贮饲料的制作与保存造成了一定的影响。因此，本试验利用了辣木叶青贮里有潜力的优质乳酸菌菌株，重新添加到辣木叶青贮的制作中，并将青贮分别置于15 和30 ℃的环境中保存，以探究环境温度和不同植物乳酸菌菌株对辣木叶青贮的发酵品质与营养成分的影响，希望对辣木叶的青贮技术提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 乳酸菌的制备

试验所用的辣木品种为PKM-1，来源于云南辣木种子资源库，2019 年5 月于华南农业大学试验田人工采摘辣木叶。采叶后用铡刀进行切割，长度约2 cm，将切碎的辣木叶混合均匀，按照试验设计分装至聚乙烯塑料袋（20 cm×30 cm）中，每袋约200 g，真空封口机抽真空并密封保存。参照Zhang 等［11］的研究，经过60 d 青贮发酵后，分离出96 株乳酸菌菌株，并鉴定和筛选出4 个菌株，分别是Lactobacillus plantarum（LP），Lactobacillus far⁃ciminis（LF），Weissella thailandensis（W）和Lactococcus lactis（E）。紧接着进行第二部分的青贮试验。

1.2 试验设计

本试验采用双因素完全随机设计，因素一为不同贮藏温度，分别为15（T1）和30 ℃（T2）。因素二为添加不同的乳酸菌，添加量为 1×106cfu·g-1鲜样（fresh matter，FM），分别为CK，LP，LF，W，E，将乳酸菌添加剂喷洒在切碎辣木叶上并混合均匀后装袋，每组6 个重复，总共30 袋青贮。CK 为空白对照组，添加等量的蒸馏水并均匀混合后装袋。青贮方法同上所述，每组随机选取3 袋青贮辣木，分别放进温度为15 和30 ℃的培养箱进行贮藏。在60 d 后进行开袋，对其化学成分和青贮品质进行测定分析。各个试验指标的测定方法均参照王成等［12］的研究，并在其方法上做适当的补充和修改。

1.3 试验指标测定

1.3.1 发酵品质及微生物计数测定方法 pH 值的测定方法：开袋时，取混匀后的青贮样品20 g，加入180 mL蒸馏水，混合均匀，用榨汁机榨汁1 min，4 层纱布过滤后再用中速定性滤纸过滤，得到浸提液，采用pH 计测量pH 值［13］。

干物质（dry matter，DM）测定方法：将辣木叶片混合均匀后，随机取样称重置于65 ℃恒温烘箱中，烘至绝干后再称重，干物质含量=绝干样重量/鲜样重量。

乳酸菌、大肠杆菌、酵母菌和霉菌的数量测定方法：随机取混匀后叶片样品20 g，加入180 mL 无菌的生理盐水，充分振荡均匀后逐级稀释。以平板计数法测定各微生物数量，乳酸菌采用MRS 琼脂培养基［每升配方：蛋白胨 10.0 g；牛肉浸粉5.0 g；酵母提取物 4.0 g；葡萄糖20.0 g；吐温-80，1.0 mL；磷酸氢二钾2.0 g；乙酸钠 5.0 g；柠檬酸三铵2.0 g；七水合硫酸镁0.2 g；四水合硫酸锰0.05 g；琼脂15.0 g；最终pH（6.2±0.2）］，大肠杆菌采用结晶紫中性红胆盐琼脂培养基［每升配方：蛋白胨7.0 g；酵母提取物3.0 g；乳糖10.0 g；氯化钠5.0 g；胆汁盐3 号1.5 g；中性红0.03 g；结晶紫0.002 g；琼脂15.0 g；最终pH 值（7.4±0.2）］，酵母菌和霉菌采用孟加拉红（虎红）培养基（每升配方：蛋白胨5.0 g；葡萄糖10.0 g；磷酸氢二钾1.0 g；七水合硫酸镁0.5 g；琼脂15.0 g；孟加拉玫瑰红0.033 g；氯霉素0.1 g）。培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司。

有机酸的测定方法：采用岛津GC-14 型高效液相色谱仪（色谱柱：Shodex Rspak KC-811 s-DVB gel column，日本；检测器：SPD-M10AVP）测定乳酸（lactic acid，LA），乙酸（acetic acid，AA）含量［14］。

1.3.2 蛋白质含量与纤维含量的测定 粗蛋白质（crude protein，CP）测定方法：按照凯氏定氮法［15］，称量0.5 g 辣木叶干粉，加入浓硫酸和催化剂（硫酸钾和硫酸铜）消煮完成后，用凯氏定氮仪（FOSS，Kjeltec 8400，丹麦）测定粗蛋白质含量。

非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）测定方法：三氯乙酸沉淀法。称取0.5 g 发酵前后样品的辣木叶干粉，用15%三氯乙酸溶液充分浸泡，用定量滤纸过滤，无损地取得过滤后的残渣，残渣连同滤纸烘干后，按照粗蛋白质测定方法，用凯氏定氮仪测定含氮量，即非蛋白氮的含量［16］，真蛋白质（true protein，TP）的含量经公式计算得出：TP=CP-NPN。

氨态氮（ammonium nitrogen，NH3-N）测定方法：苯酚-次氯酸钠比色法［17］。配制以绝干（NH4）2SO4为标准品的标准铵溶液，并制作标准曲线，经预试验后，向适量样品浸提液加入5 mL 苯酚溶液和4 mL 次氯酸钠溶液，置于95 ℃恒温水浴锅反应5 min，冷却后于630 nm 波长下测OD 值，计算得出含量。

游离氨基酸氮（free amino acid，FAA）测定方法：茚三酮-硫酸肼比色法［18］。

纤维含量的测定：按照范氏纤维法［19］测定，计算得出酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）和中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）的含量。

1.3.3 单宁含量的测定 水解单宁测定方法：用70%丙酮充分混匀浸泡辣木叶样品干粉，并用超声波处理1 h，使其充分浸提，将浑浊液用高速离心机8000 r·min-1离心10 min 并收集上清液，制作以没食子酸为标准品的标准曲线，采用Folin-Ciocalteu 试剂比色法［20］测定总酚和简单酚含量，水解单宁含量=总酚含量-简单酚含量。

缩合单宁测定方法：称取20 mg 辣木叶干粉样品加10 mL 丙酮-丁醇-氯化氢试剂，充分振荡混匀，置于70 ℃恒温水浴锅中反应2.5 h，冷却后用高速离心机8000 r·min-1离心5 min，在554 nm 波长下测OD 值，制作以原花青素为标准品的标准曲线，计算缩合单宁含量［20］。

1.4 数据统计

采用SPSS 19.0 进行双因素方差分析（Two-way ANOVA），两个因素互作时用Duncan 氏对各组进行多重比较，P＜0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 辣木叶原料

表1 展示了辣木叶原料的特性。辣木叶原料的干物质含量为21.59%，CP 含量为25.31%DM，NDF 和ADF的含量分别为24.91%DM 和16.66%DM。WSC 含量为7.53%DM。水解单宁与缩合单宁的含量分别为1.62%DM 和2.48%DM。原料中微生物含量较丰富，乳酸菌、大肠杆菌和霉菌的数量分别为4.45，5.99 和2.80 log10cfu·g-1FM。

2.2 辣木叶青贮60 d 的青贮品质

由表2 可知，辣木叶青贮60 d，T2温度组的干物质含量显著高于T1温度组（P＜0.05）。T1、T2温度组添加植物乳酸菌后，pH 值均显著下降（P＜0.05），但T1和T2温度组的pH 值无显著差异。T1温度组的乳酸和乙酸含量，在添加植物乳酸菌后均有显著升高（P＜0.05）；而T2温度组的乳酸和乙酸含量仅在添加W 和E 时显著提升（P＜0.05）。T2温度组乳酸和乙酸含量均显著高于 T1温度组（P＜0.05）。T1温度组乳酸菌数量在添加植物乳酸菌W 和E 后显著降低（P＜0.05）。T1温度组的乳酸菌数量显著高于T2温度组（P＜0.05）。方差分析结果表明，温度对除pH 外的指标均有极显著影响（P＜0.01），乳酸菌添加剂对除DM 外各个指标均有极显著影响（P＜0.01），二者的交互作用对pH 值和乳酸、乙酸含量均有显著影响（P＜0.05）。

表1 辣木叶原料的特点Table 1 The characteristic of raw M. oleifera leaves material（n=3）

表2 植物乳酸菌和贮藏温度对60 d 青贮辣木叶品质的影响Table 2 Effect of temperature and inoculants on character of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

2.3 辣木叶青贮60 d 的营养成分

由表3 可知，T1温度组在添加植物乳酸菌LP 和LF 时CP 含量显著降低（P＜0.05）。T2温度组在添加植物乳酸菌LF 和E 时CP 含量显著降低（P＜0.05）。T1、T2温度组的NH3-N 含量在添加植物乳酸菌后显著下降（P＜0.05）。TI温度组的FAA 含量在添加植物乳酸菌后显著上升（P＜0.05）。T1温度组的TP 含量显著高于T2温度组（P＜0.05）。T1温度组的NPN、NH3-N 和FAA 含量均显著低于T2温度组（P＜0.05）。方差分析结果表明，温度对TP、NPN、NH3-N 和FAA 含量均有极显著影响（P＜0.01），乳酸菌添加剂对CP 和NH3-N 的含量有极显著影响（P＜0.01），二者的交互作用对 CP、NH3-N 和 FAA 均有极显著影响（P＜0.01），对 NPN 有显著影响（P＜0.05）。

表3 植物乳酸菌和贮藏温度对60 d 青贮辣木叶纤维和蛋白含量的影响Table 3 Effect of temperature and inoculants on protein and fibre content of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

2.4 辣木叶青贮60 d 的单宁含量

由表4 可知，T2温度组在添加植物乳酸菌E 后，总酚含量显著下降（P＜0.05）。T1温度组在添加植物乳酸菌E 后，水解单宁含量显著升高（P＜0.05）。通过方差分析，植物乳酸菌对简单酚和缩合单宁的含量有显著影响（P＜0.05），温度与植物乳杆菌的交互作用对总酚和水解单宁的含量有显著影响（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 辣木叶原料的特点

本试验中辣木叶原料的CP 含量较高，为25.31%DM，高于王成等［12］报道的16.72%，略低于刘昌芬等［21］研究中的 27.5%DM。NDF 和 ADF 含量分别为 24.91%DM 和 16.66%DM，均低于 Wang 等［22］的报道。原料营养成分含量的不同，可能是由于不同的地理位置、气温、品种和作物生长期等因素［12］。辣木原料的WSC 含量较高（7.53%DM），达到了张庆［23］报道的制作优质青贮饲料并良好保存的标准。但是原料中的乳酸菌数量没达到Cai等［24］报道的良好青贮饲料的标准（＞5.0 log10cfu·g-1），而且较高数量的大肠杆菌（5.99 log10cfu·g-1）可能会影响青贮辣木叶的品质。

表4 植物乳酸菌和贮藏温度对60 d 青贮辣木叶单宁含量的影响Table 4 Effect of temperature and inoculants on tannins content of M.oleifera leaves silage in 60 days（n=3）

3.2 辣木叶青贮60 d 品质

青贮饲料的pH 值是用来衡量青贮品质的一个重要指标，尤其是对于高水分含量的青贮。当青贮饲料pH 值低于4.2 时，往往认为青贮饲料能得到良好的发酵效果，而pH 值高于4.2 时，常出现更多的腐败现象［25］。在本试验中，所有青贮辣木叶的组别的pH 值均低于4.2，由此可见辣木是一种易于达到良好青贮品质的木本饲料。

由于辣木的原料有较多有害微生物，且原料的乳酸菌数量较少，添加乳酸菌可使青贮饲料快速积累乳酸且降低pH 值，并在青贮早期抑制有害微生物的生长［24，26］。本试验中，添加乳酸菌后，pH 值显著下降，LA 含量显著提高，且有害微生物仅在个别组出现。与此同时，添加乳酸菌使NH3-N 含量显著降低。NH3-N 含量一般反映着青贮饲料蛋白质降解的水平，含量降低说明蛋白质组分得到了较好的保存，原因可能是加菌处理组相对较低的pH值。乳酸菌数量在添加乳酸菌添加剂后出现下降。根据Ohmomo 等［27］的报道，很多乳酸菌菌株在pH 值低于4.0的环境下有较弱的耐受性，本试验中处理组的pH 值全部低于4.0，可能是乳酸菌数量减少的原因。值得一提的是，添加乳酸菌后AA 含量显著提升，提升量不大，虽然AA 常由LA 的分解产生，但因为添加乳酸菌后，LA 的大量积累，所以能解释AA 含量的少量提高，且青贮饲料里含有适量的AA，可以抑制酵母菌生长，提高有氧稳定性。然而，T2组的有机酸含量显著高于T1组，两组的pH 值却没有显著差异，一般来说，有机酸含量直接影响pH 值高低，这可能是由于蛋白降解在T2组比较多，造成T2组有较强的缓冲能力，所以更多的有机酸却不能得到更低的pH 值。总的来说，添加乳酸菌后能改善青贮辣木的发酵品质，减少有害菌产生，并有利于乳酸等有机酸积累，这些结果与玉柱等［28］和田瑞霞等［29］的研究报道一致。

贮藏温度是影响青贮品质的一个重要因素，同时也影响着乳酸菌添加剂的活性和效果［10，30］。T2温度组的乳酸菌数量显著低于T1温度组，且降低了TP 含量。同时，T2温度组的NPN、NH3-N 和FAA 含量均显著高于T1温度组。说明较高的环境温度容易导致比较明显的蛋白质降解。Liu 等［30］也报道了相似的结果，在15 ℃的贮藏温度下，青贮饲料拥有更好的发酵品质，包括更低的NH3-N 含量。青贮饲料中NH3-N 的积累常由植物蛋白酶的合成活性影响［31］。可能植物蛋白酶在较高温度时的水解活性更高，导致了青贮饲料里NH3-N 含量更高［32］。

综上所述，添加植物乳酸菌和较低的贮藏温度显然能带来更好的辣木叶青贮品质和良好的营养成分的保存。

3.3 辣木叶青贮60 d 单宁含量

植物单宁又称植物多酚或者鞣酸，根据结构可以分为缩合单宁和水解单宁，味苦涩，适口性差，可与蛋白质等营养物质发生反应，降低动物消化率，甚至还存在毒害动物的风险［33］。降低单宁的抗营养作用，可通过多种手法解决，而通过微生物分解木本饲料中的单宁则是常用手段之一［34］。本试验中，通过青贮发酵，无论是否加菌，都发现单宁含量相比原料下降，在T1温度组下更为明显。这可能是由于青贮饲料中的微生物产生了单宁酶［35］，对辣木中的单宁产生了一定程度降解。单宁酶活性受pH 影响很大，最适pH 为6.0～6.5，本试验pH 值相对较低，可能影响了单宁酶的活性，导致单宁含量的变化不显著［12，19］。

4 结论

辣木叶营养价值较高，适合作为动物饲料蛋白源的补充。青贮时添加植物乳酸菌，可以改善青贮品质，并对营养成分有更好的保留。结果显示乳酸菌帮助辣木叶青贮降低pH 值，提升乳酸含量，而较低的贮藏温度可以减少蛋白质分解，降低了非蛋白氮，氨态氮和游离氨基酸等含量。通过添加乳酸菌青贮，可以降低辣木叶中的单宁含量，但影响不显著。