连翘叶乙醇提取物抗小鼠蓖麻油性腹泻活性及其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响研究

陈贵宇，李春臣，辜春霞，杨晨，江兰，罗涛，梅雪，张建武*

腹泻通常是由肠道疾病引起的症状，可由各种细菌（大肠埃希菌、志贺菌种、霍乱弧菌等）、病毒（诺如病毒、巨细胞病毒等）和寄生虫引起［1］。腹泻是严重影响人类健康和社会经济发展的多发病之一，尽管治疗腹泻的有效药物较多，但中药治疗腹泻具有疗效迅速、不良反应少、费用低廉等优势［2］。因此，世界卫生组织（WHO）仍鼓励寻找传统的抗腹泻中药［3］。

连翘是临床常用中药之一，为木犀科植物连翘Forsythia suspensa（Thunb.）Vahl的干燥果实，味苦、无毒、性微寒，具有清热解毒、消肿散结的功效［4］，其药理作用主要有抗菌、保肝、非特异性免疫、保护心脏、抗氧化等。有研究表明，连翘属植物叶子与果实的成分和药理作用有较好的一致性［5］，而连翘叶中的黄酮类化合物具有良好的抑菌活性［6］，更好地印证了其药理作用。

本研究采用蓖麻油诱导的小鼠急性腹泻模型，观察连翘叶乙醇提取物（FS ext）对小鼠蓖麻油性腹泻的影响，同时探讨其对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响。

本研究创新点与不足：

（1）探究了连翘叶对肠平滑肌收缩的影响以及在腹泻方面的应用，此前对于连翘叶这方面药用价值的研究鲜少，丰富了其药用方向，同时也为这方面的研究提供了一定的理论依据。（2）对于连翘叶在腹泻方面的应用，没有明确模型针对的是临床上的何种腹泻。

1 材料与方法

1.1 研究时间 2018年6—12月。

1.2 药物提取 于四川省南充市采集连翘叶（CBY-2016-0003），经川北医学院药学院梅雪老师鉴定。将连翘叶放在恒温（60 ℃）电炉中干燥，粉碎成粗粉（粉碎机：FW177，泰斯特，天津），取50 g（使用电子分析天平：Mettle AE 240）放入1 L的圆底烧瓶中，用7倍于测量质量的乙醇作为溶剂，回流、萃取3次，滤液回收溶剂（旋转蒸发器：RE-52AA，雅荣，上海）浓缩，在真空减压干燥炉（ZK 6050B，Opson，武汉）中干燥得到FS ext，浸出率为24.55%。

1.3 植物化学分析

1.3.1 初步植物化学分析 对FS ext进行植物化学分析，以确定可能存在的苷类、多酚、黄酮类、多糖和有机酸［7］。水提液振荡后形成泡沫，说明FS ext中有皂苷；加入FeCl3试剂出现蓝绿色，说明FS ext中有酚类物质；加入AlCl3试剂出现黄色，说明FS ext中有黄酮类物质。

1.3.2 总黄酮含量测定 根据文献［8］测定FS ext的总黄酮含量。将0.5 ml FS ext与1.5 ml乙醇（75%v/v）、0.1 ml氯化铝（10% w/v）、0.1 ml乙酸钾（1 mol/L）和2.8 ml双蒸馏水混合，室温下培养30 min，然后用1750紫外-可见分光光度计（日本岛津）在435 nm处测量吸光度。用蒸馏水（0.1 ml）代替氯化铝作空白。芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，且易分离，作为对照品比较易得，故本研究以芦丁作为标定曲线的标准对照，结果用芦丁当量mg/g提取物表示。

1.3.3 高效液相色谱法鉴别FS ext中的化学成分 采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行鉴别和检测，色谱柱为Aglient-ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水溶液为流动相，采用梯度洗脱（流动相A为水，流动相B为乙腈，梯度洗脱条件见表1），结合波长切换技术于20 min将检测波长从330 nm切换为277 nm进行化学成分检测，流速为0.6 ml/min，柱温 28 ℃，进样量 5 μl。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution condition

1.3.3.1 对照品溶液制备 取连翘苷和连翘酯苷A对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每 1 ml含0.265 mg连翘苷和0.373 mg连翘酯苷A的混合对照品溶液，混匀，过0.22 μm微孔滤膜，备用。

1.3.3.2 供试品溶液制备 取FS ext 0.105 50 g，加甲醇定容至1 ml容量瓶中，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

1.4 实验药品及试剂 碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、磷酸二氢钠、氯化钠、氯化钙、氯化铁、氯化铝、醋酸钾〔成都市科隆化学品有限公司〕，氯乙酰胆碱〔成都华夏化学试剂有限公司（中国成都）〕，蓖麻油（河南省华龙药业有限公司），维拉帕米〔Medchemexpress有限公司（美国）〕，洛哌丁胺〔西格玛化学公司（美国圣路易斯）〕，色谱乙腈（成都市科隆化学品有限公司），纯化水（杭州娃哈哈集团有限公司），盐酸〔成都市科隆化学品有限公司〕、氯化铁、甲醇（重庆腾华化工有限公司）、醋酸钾和氯化铝用于粗提物的植物化学分析。蒸馏水（四川优普超纯科技有限公司）用于制备标准溶液、稀释液和生理盐溶液（Tyrode溶液）。

1.5 仪器 家兔类通用实验器械，HW-400E恒温平滑肌槽（四川成都泰盟公司），BL-420F生物机能实验系统（四川成都泰盟公司），FT-100生物张力传感器（四川成都泰盟软件有限公司），优普纯水/超纯水制造系统（四川优普超纯科技有限公司），HH600-2B三用恒温水浴箱（金坛市科析仪器有限公司），电热恒温鼓风干燥箱（YDYQ，101-2A），粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司，FW177），电子分析天平（Mettle AE 240），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，RE-52AA），真空减压干燥箱（武汉奥普森试验设备有限公司，ZK 6050B）。

1.6 实验动物 选取110只健康昆明雌雄小鼠（18～22 g）以及42只健康家兔（2.0～2.5 kg），由川北医学院动物中心提供〔许可证编号：SYXK（chuan）2013-076〕，小鼠和家兔饲养于23～26 ℃、湿度适宜的实验室环境，12 h光照黑暗循环，期间可自由进食和饮水。本实验符合中国动物保护委员会的管理，并遵循动物伦理和实验准则。

1.7 实验方法

1.7.1 FS ext的急性毒性 取60只禁食4 h（可自由饮水）的小鼠随机分为0.5 g/kg FS ext试验组、1.0 g/kg FS ext试验组、2.0 g/kg FS ext试验组、4.0 g/kg FS ext试验组、8.0 g/kg FS ext试验组、16.0 g/kg FS ext试验组，每组10只，分别给予0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kg、4.0 g/kg、8.0 g/kg、16.0 g/kg的FS ext进行灌胃，处理后的小鼠可自由饮水进食，记录14 d内小鼠的死亡情况和毒性迹象，建立相应的剂量-效应曲线，从而确定FS ext的半数致死剂量（LD50），以确定其安全性［9］。

1.7.2 对蓖麻油性腹泻的影响 另取50只小鼠随机分成阴性组、阳性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组，每组10只，阴性组给予0.9%氯化钠溶液（20 ml/kg）灌胃，阳性组给予洛哌丁胺（4 mg/kg）灌胃，0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组、1.00 g/kg FS ext试验组分别给予0.25、0.50、1.00 g/kg FS ext。给药30 min后，小鼠均给予蓖麻油0.4 ml灌胃，然后将每只小鼠放入单独的笼子中，地板衬有吸墨纸，将线网放置在离底部3 cm的笼中以使小鼠与吸墨纸隔开。观察4 h内以下指标：初始半固体粪便时间，固体、半固体、液体粪便数量。采用腹泻指数（EI）评估腹泻的严重程度［10］。EI=固体粪便数量×1+半固体粪便数量×2+液体粪便数量×3。

1.7.3 离体标本制备 选取健康家兔，实验前禁食24 h，自由饮水。用木槌击致头昏，解剖家兔，以胃幽门与十二指肠交界处为起始部，取空肠并立即放入通有95% O2和5% CO2混合气的台氏液中，将内容物冲洗干净并剪去肠系膜，剪成1.5～2.0 cm数段，一端用线结扎固定于通气沟，另一端固定于张力换能器。给予前负荷1 g，浴槽内温度维持在（37.0±0.5）℃，通气沟以每秒1～2个气泡的速度持续通入混合气，待基线稳定后开始实验［11］。

1.7.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 待空肠平滑肌张力稳定后，单剂量加入FS ext（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，这些浓度是累加所得，即后一个的浓度由前一个浓度累加，主要目的是为了观察家兔离体空肠平滑肌自发性收缩随FS ext的浓度变化而变化的趋势），以给药前的张力为100%，记录给药后空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 μmol/L）处理家兔离体空肠平滑肌作为对照，记录给予维拉帕米后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的张力变化。

1.7.5 FS ext对由乙酰胆碱（ACh）和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 待空肠平滑肌张力稳定后，分别加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）预处理，出现最大波峰后，立即用台氏液冲洗肠管，等其稳定后，再次分别加入ACh（10 μmol/L）和KCl（60 μmol/L），15 min后，加入FS ext使其终浓度分别达0.01、0.03、0.10、0.30、1.00、3.00、10.00 mg/ml，并记录空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。按照上述方法，用维拉帕米（0.001、0.010、0.100、1.000、3.000 μmol/L）处理家兔离体空肠作为对照，重复上述步骤，并记录此时空肠平滑肌自发性收缩稳定时的张力变化。

1.7.6 FS ext对由CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 为确定FS ext对Ca2+内流的影响，首先让肠管处于Tyrode溶液中，待其张力稳定后，将Tyrode溶液换为含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续30 min以从组织中除去Ca2+。再将溶液换为不含EDTA的无Ca2+高K+溶液，持续15 min，然后再加入FS ext（0.3、1.0 mg/ml），构建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效曲线，观察给予不同剂量FS ext后家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率的变化。在加入维拉帕米（1 μmol/L）的情况下，构建CaCl2（3×10-5～3×10-2mol/L）的量-效关系曲线，观察空肠平滑肌自发性收缩率变化。在没有FS ext和维拉帕米预处理的情况下，将3×10-2mol/L CaCl2诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩率认为是100%［12］。

1.8 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行数据分析，计量资料以（±s）表示，组间比较用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 植物化学分析

2.1.1 初步植物化学分析 对FS ext的初步植物化学分析表明其含有酚类、皂苷类和黄酮类化合物。

2.1.2 总黄酮的含量 FS ext中黄酮含量的测定表明，黄酮含量为8.13 mg/g。

2.1.3 高效液相色谱法检测FS ext中的化学成分 采用高效液相色谱法对FS ext中的化学成分进行检测，结果显示，FS ext中主要含连翘苷和连翘酯苷A。在上述1.3.3的色谱条件下，连翘苷和连翘酯苷A的分离度良好，空白、混合标准品、样品的色谱图见图1。

图1 空白（A）、混合标准品（B）、连翘叶乙醇提取物样品（C）的HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of blank（A），reference substances（B），and sample（C）

2.2 FS ext的急性毒性 在测量LD50的实验过程中，小鼠按不同剂量的FS ext进行灌胃后，在观察期内未出现任何死亡或毒性迹象。单次给予FS ext的剂量为16 g/kg，小鼠在观察期内未出现任何的死亡及行为变化。

2.3 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响 5组初始半固体粪便时间和EI比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。阳性组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）；1.00 g/kg FS ext试验组初始半固体粪便时间长于阴性组、0.25 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性组EI高于阳性组、1.00 g/kg FS ext试验组，差异有统计学意义（P＜0.05）；0.25 g/kg FS ext试验组、0.50 g/kg FS ext试验组EI高于阳性组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表2 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

表2 FS ext对小鼠蓖麻油性腹泻的影响（±s）Table 2 Effect of ethanol extract from Forsythia suspensa （FS ext） on castor oil-induced diarrhea in mice

注：FS ext=连翘叶乙醇提取物，EI=腹泻指数；与阴性组比较，aP＜0.05；与阳性组比较，bP＜0.05；与0.25 g/kg FS ext试验组比较，cP＜0.05

组别 只数 初始半固体粪便时间（min） EI阴性组 10 65.50±35.87 16.80±4.42阳性组 10 119.50±48.50a 8.40±5.61a 0.25 g/kg FS ext试验组 10 54.90±23.30b 15.60±7.74b 0.50 g/kg FS ext试验组 10 83.10±32.69 13.90±4.32 1.00 g/kg FS ext试验组 10 104.00±40.99c 10.50±5.06 F值 4.610 3.582 P值 0.003 0.013

2.4 FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响 台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩无明显影响，差异无统计学意义（P＞0.05，见图2）。FS ext对家兔离体空肠平滑肌表现出剂量依赖性解痉作用，即半最大效应浓度（EC50）=1.21 mg/ml（1.11～1.26 mg/ml，n=6），见图3。图形类似于维拉帕米（0.01～10 μmol/L），其 EC50 为 0.51 μmol/L（0.42～0.59 μmol/L，n=6），见图4。

图2 台氏液对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 2 The effect of Tyrode's solution on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

图3 不同浓度FS ext对离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 3 Effects of different concentrations of FS ext on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

图4 不同浓度维拉帕米对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响Figure 4 Effects of different concentrations of verapamil on the spontaneous contraction of rabbit isolated jejunal smooth muscle

2.5 FS ext对ACh和KCl诱导的家兔离体空肠收缩的松弛作用 FS ext能浓度依赖性地抑制由ACh诱导的肠管 收 缩，EC50=0.99 mg/ml（0.91～1.02 mg/ml，n=6），最大抑制率为84.75%，其量-效关系曲线变化见图5A。此外，FS ext也能够以浓度依赖的方式抑制由KCl诱导的肠管收缩，EC50=0.63 mg/ml（0.58～0.67 mg/ml，n=6），最大抑制率为91.45%，其量-效关系曲线变化见图5A。FS ext对ACh和KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌收缩的松弛作用与维拉帕米在0.001～3.000 μmol/L时相似，EC50值分别为0.25 μmol/L（0.20～0.29 μmol/L，n=6） 和 0.041 μmol/L（0.033～0.047 μmol/L，n=6），其量-效关系曲线变化见图5B。

图5 不同浓度FS ext和不同浓度的维拉帕米对ACh（10 μmol/L）和KCl（60 mmol/L）诱导的兔离体空肠收缩的影响Figure 5 Effects of different concentrations of FS ext and verapamil on the contraction of rabbit isolated jejunum induced by ACh （10 μmol/L） or KCl （60 mmol/L）

2.6 FS ext对CaCl2诱导的空肠收缩的影响 FS ext以浓度依赖的方式抑制CaCl2诱导的肠管收缩，最大抑制率为52.13%，进一步研究发现，随着FS ext剂量的增加，形成的CaCl2量-效关系曲线向右下方移动，这与维拉帕米引起的CaCl2量-效关系曲线变化类似，见图6。

3 讨论

在蓖麻油诱导的小鼠急性腹泻模型中，蓖麻油通过刺激小肠，损伤小肠黏膜细胞，促进炎性递质合成和释放，导致肠腔内积液而出现急性腹泻；此外，蓖麻油能减少Na+和K+主动吸收，降低小肠和结肠Na+-K+ATP酶活性［13］。蓖麻油中含有的蓖麻油酸能够引起局部刺激和肠黏膜炎症，从而导致前列腺素释放，增强胃肠动力［14］。蓖麻油诱导小鼠腹泻实验中，试验组与阴性组相比，小鼠EI明显降低，初始半固体粪便时间延长。根据植物化学分析，FS ext中含有黄酮类化合物［15］。因为萜烯、黄酮类化合物和萜类化合物可以抑制自体蛋白和前列腺素的释放［16］，所以根据实验结果推测，FS ext中可能含有抑制前列腺素释放的物质，从而抑制小鼠蓖麻油性腹泻。

通过探究FS ext对家兔离体空肠平滑肌自发性收缩的影响，发现其表现出一定的剂量依赖性解痉作用，进一步印证FS ext可以抑制蓖麻油诱导的小鼠腹泻。ACh是肠神经系统中主要的兴奋性神经递质［17］，可通过激活毒蕈碱受体（M受体）诱导平滑肌自发性收缩。肠神经系统的副神经系统和内在神经元通过释放ACh、激动肠平滑肌细胞膜上的M受体而增加其收缩活性，促进肠道蠕动［18］。在FS ext对ACh诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩影响实验中，FS ext试验组空肠收缩变化率呈下降趋势，与维拉帕米组的实验结果一致，提示FS ext能够舒张ACh诱导的离体空肠平滑肌自发性收缩，因此FS ext舒张肠平滑肌的作用可能与阻断M受体有关。平滑肌的收缩取决于细胞质中Ca2+的存在，细胞外的Ca2+通过细胞表面的L-型钙离子通道进入细胞内，或是通过细胞内肌浆网释放Ca2+，从而使得细胞内Ca2+升高［19］。因此，钙通道的阻断或是细胞内储存的Ca2+释放量减少均会减弱平滑肌的收缩。在细胞兴奋过程中，L-型钙离子通道可调节细胞内Ca2+浓度保持在参考范围，即钙稳态的主要离子通道［20］。由之前的文献可知，高浓度的K+水平可打开电压依赖性L-型钙离子通道并允许细胞外Ca2+进入细胞内，从而促进肠平滑肌的收缩［21-22］。FS ext可松弛高K+诱导的肠平滑肌自发性收缩，提示可能有钙拮抗剂的存在［23］。因此，为验证这一猜想，本实验使用KCl溶液诱导肠管收缩，并将维拉帕米作为对照组，维拉帕米是一种L-型钙离子通道阻断剂［24］。实验结果显示，FS ext能松弛KCl诱导的家兔离体空肠平滑肌自发性收缩，且随着FS ext浓度的增加，形成的CaCl2量-效关系曲线向右下方移动，这与维拉帕米引起的CaCl2量-效关系曲线变化类似。提示FS ext抑制家兔离体空肠平滑肌的收缩可能与阻断L-型钙离子通道有关。

综上，FS ext有明显的抗小鼠蓖麻油性腹泻作用，可抑制家兔离体空肠平滑肌的自发性收缩和ACh和KCl诱导的空肠收缩，其机制可能与阻断M受体和抑制L型-钙离子通道有关。

作者贡献：陈贵宇进行文章的构思与设计，文献资料收集、整理，撰写论文，论文的修订并对文章负责；李春臣进行数据的整理，文章中图表的绘制，论文的修订；辜春霞、杨晨、江兰进行研究实施，数据收集；罗涛、梅雪进行数据提供，质量控制；张建武负责文章的质量控制与审校，对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。