巨噬细胞表型对子宫内膜异位症性不孕患者疗效及性激素水平的影响

陈 捷，姜桂芳，黄国伟（暨南大学附属顺德医院妇产科，广东佛山 528305）

子宫内膜异位症性不孕症(EI)患者常表现为继发性不孕、衍生性痛经、月经不规律、性交疼痛，有时可出现消化系统、泌尿系统等不典型性症状[1-3]。EI不但给患者身体上带来痛苦，更给患者心理及家庭带来困扰。研究表明，炎症反应相关介质引起的子宫慢性炎症性疾病是导致 EI的重要原因之一，与该疾病的发展和预后有密切关系[4-6]。人体内炎症因子的长期异常增加、子宫内炎症因子的异常积聚都是导致该病发生、发展的重要病理因素[7-8]。炎症细胞不但存在于血管内，同时也能从血管内渗出至血管外组织中成为组织固有细胞，其中巨噬细胞在炎症反应中发挥了重要的作用[9-10]。本研究探讨了不同巨噬细胞表型对 EI患者临床治疗效果及性激素水平的影响，现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选择2017年1月至2019年12月我院收治的 39例 EI患者为研究对象，年龄为23～36岁，平均(26.5±3.4)岁。纳入标准：(1)自愿参与本项目的研究；(2)年龄为20～36岁的育龄期妇女；(3)不合并泌尿生殖系统外其他系统临床确诊的急性、亚急性感染性疾病；(4)测试期间不存在感冒、发烧等上呼吸道感染性疾病；(5)无临床确诊的其他系统肿瘤性疾病；(6)无传染性疾病。排除标准：(1)临床确诊除外其他明确病因所致的不孕症；(2)自动要求退出者。

1.2 方法

所有患者均采用腹腔镜保守手术治疗，剔除卵巢囊肿时，小心将囊腔内巧克力色样黏稠液吸出，用生理盐水反复冲洗干净；囊性液全部吸除后，打开卵巢皮质菲薄处对囊壁进行钝性分离，一部分组织送检，一部分组织用于巨噬细胞收集。完成分离后，再用生理盐水反复冲洗干净，伤口缝合止血。所有患者术后第1 周开始使用短效口服避孕药去养孕烯炔雌醇片，1片/次，每天1次，持续 3周停药 1周为1个疗程，共治疗6个疗程。

1.3 研究指标

1.3.1 巨噬细胞表型 将刮取的组织用0.25%胰蛋白酶消化5～10 min，然后用含10% FBS的 DMEM培养基终止消化，75 μm筛网过筛后，1000 r/min离心10 min，然后用预冷的 PBS洗涤细胞 3次，离心后获取细胞，加入70%预冷乙醇放置于 4℃冰箱中固定 8 h。再次用PBS洗涤细胞 3次，然后加入流式抗体APCF4/80、PE-CD16及 PE-CD163抗体，室温避光孵育30 min，加入 PBS 1 mL洗涤细胞，1000 r/min离心5 min，弃去上清，4%多聚甲醛200 μL固定，上流式细胞仪检测。分型标准：CD16阳性率高于CD163阳性率为 M1型，CD163阳性率高于 CD16阳性率为M2型[8]。

1.3.2 患者病情症状体征评分 根据患者盆腔症状(盆腔痛、性交痛、痛经)、体征(盆腔触痛、硬块或硬结)进行评分，每个症状或体征有为 1分，无为0分，分值范围为0～5分，分数越高，病情越重[6]。

1.3.3 性激素指标 采用全自动生化分析仪及放射免疫法检测所有患者治疗前月经第3天(治疗前)、治疗结束恢复月经后第3个月经周期时月经第3 天(治疗后)的性激素指标，包括黄体生成素(LH)、卵泡雌激素(FSH)、雌二醇(E2)、抗苗勒管激素(AMH)和窦卵泡数目AFC。

1.3.4 治疗效果 疗效评价在出院后第6个月时进行评估。根据患者的临床症状、体征、影像学及实验室检查结果分为显效、有效、无效 3个等级：症状和体征完全消失，影像学及实验室检查结果完全正常为显效；症状和体征完全消失，影像学及实验室检查结果较治疗前明显改善为有效；症状和体征完全消失，影像学及实验室检查结果无明显变化或加重为无效[6]。

1.4 统计学处理

实验数据经SPSS 20.0统计学软件进行分析，计量资料正态分布以±s表示，偏态分布资料以中位数(四分位间距 IQR)表示，分别采用两独立样本t检验或 Mann-Withney U检验；计数资料以例(%)表示，采用χ2检验；有序分类资料采用秩和检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EI患 者病变子宫内膜巨噬细胞表型分析

39例 EI患者中，有 22例分离出的巨噬细胞CD16阳性率高于 CD163阳性率，为 M1型；17例分离出的巨噬细胞 CD163阳性率高于 CD16阳性率，为M2型。见表1。

表1 EI患者病变子宫内膜巨噬细胞表型分析(%)

2.2 M1型和M2型EI患者的症状体征评分的比较

治疗前，M1型患者症状特征评分高于 M2型患者(P＜0.01)。治疗后，M2型和M1型患者症状特征评分较治疗前降低，但 M1型患者症状特征评分仍高于M2型患者(P＜0.01)。见表2。

表2 M1型和M2型 EI患者治疗前后症状体征评分的比较(±s，分)

表2 M1型和M2型 EI患者治疗前后症状体征评分的比较(±s，分)

与同组治疗前比较：aP＜0.01；与M1型比较：b P＜0.01

2.3 M1型和M2型EI患者性激素指标的比较

治疗前，M1型患者的 LH、FSH、E2水平均高于M2型患者(P＜0.01)，而 AMH和AFC水平两型患者间差异无统计学意义(P＞0.05)。治疗后，两型患者的LH、FSH、E2均较治疗前降低，且 M1型仍高于M2型(P＜0.01)；M2型患者的 AFC亦高于 M1型患者(P＜0.01)；AMH水平两型患者间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表3 M1型和M2型 EI患者性激素指标的比较(±s)

表3 M1型和M2型 EI患者性激素指标的比较(±s)

与同组治疗前比较：aP＜0.01；与M1型比较：b P＜0.01

2.4 M1型和M2型EI患者治疗效果的比较

M2型 EI患者的治疗效果优于 M1型患者，差异有统计学意义(P＜0.01)。见表4。

表4 M1型和M2型 EI患者治疗效果的比较(例)

3 讨论

EI患者的子宫外出现子宫内膜组织发育，可形成不同的病变类型(腹膜、深部和卵巢囊)，引起慢性炎症反应，尽管这些症状的频率可能不同，但均能导致患者疼痛或不孕[1-2,11]。健康女性的月生殖力(MFR)为15%～20%，随年龄增长逐渐下降。而子宫内膜异位症患者的MFR可降至2%～10%[3,12-13]。研究证实，人体内炎症因子的长期异常增加以及子宫内炎症因子的异常积聚是导致该病发生、发展的重要因素[7-8]。巨噬细胞是最具代表性的炎症细胞，可以通过吞噬氧化修饰的脂质体和细胞碎片、分泌炎症因子和金属蛋白酶等途径介导炎症反应过程[14-16]。但是，巨噬细胞在不同的刺激因素作用下，可以向不同方向极化，从而分化为不同表型和功能的巨噬细胞[17]。其中，M1型巨噬细胞也被称为经典激活型巨噬细胞，具有抑制和杀伤肿瘤细胞等功能；M2型巨噬细胞又被称为诱导型活化型巨噬细胞，能够分泌Arginase-1、IL-10和TGF-β等抑制炎症细胞因子，促进血管生成及免疫抑制等功能[18-19]。目前，对于巨噬细胞在子宫内膜异位症的发生、发展中的影响尚不明确。

本研究结果发现在 EI患者中，病变子宫内膜组织中的巨噬细胞既有以 CD16阳性为主的 M1型，也有以 CD163阳性为主的 M2型；患者接受治疗前，M1型患者的临床症状和特征评分高于 M2型患者，即患者的临床症状和体征在 M1型患者中更为严重，经过治疗后，虽然 M1型和M2型患者的症状体征评分均较治疗前降低，但 M1型患者的症状体征评分仍然高于 M2型患者。由此可见，巨噬细胞的表型对患者的临床症状和治疗效果有一定的影响，可能与M2型巨噬细胞的抑制炎症作用相关[18]。在患者性激素水平的检测结果中发现，治疗前 M1型患者 LH、FSH、E2水平均高于 M2型患者，治疗后两型患者均较治疗前降低，但 M1型患者的 LH、FSH、E 2仍均高于 M2型患者，这也同时说明了巨噬细胞的表型对患者的临床症状和治疗效果有一定的影响，M1型患者的病情趋向更为严重，并且性激素水平改善效果更差。上述猜想在我们的临床效果评价中也得到了证实，M2型患者治疗效果明显优于 M1型患者。但是，我们目前仍不清楚巨噬细胞的表型是如何对治疗效果产生影响的，猜测可能与巨噬细胞的表型对避孕药去氧孕烯炔雌醇的作用机制有关。对于巨噬细胞在 EI患者病理、生理过程中的分子信号通路中的作用值得我们进一步深入研究。