四种柑橘果皮主要活性物质测定和抗氧化能力对比研究

蒋变玲，王志花，张东京，袁维风，陈 琼*

（1.宿州学院 生物与食品工程学院，安徽 宿州234000；2 合肥工业大学 食品与生物工程学院，安徽 合肥230009）

柑橘是世界最丰富的农作物之一[1]，也是世界上第一大水果，其果实具有重要的营养、保健和医学价值[2]。中国作为柑橘类水果的主要原产地之一，有着将近5 000 年的栽种历史，柑橘资源丰富且优良品种众多[3]。2019 年世界柑橘总产量约为9 400 万吨[1,4]，而柑橘皮占柑橘的40%～50%，产生千万吨的果皮被当做农工业废物而浪费掉并产生环境问题[1]，然而柑橘果皮是很有价值的工业副产品，可用于食品、医药和化妆品[5]。在食品行业中，橘皮提取物作为天然抗氧化剂防止油脂的酸败受到越来越多的关注[6]。并且传统中药中，柑橘皮可入药，具有促进消化[7]、止咳、消炎和抑菌等功效[2]。

柑橘果皮中的多酚类化合物和黄酮类物质含量高[1]，作为植物中生物活性物质分为酚类和萜类化合物同样在柑橘果实丰富[2]。柑橘皮黄酮可增加血清抗脂质过氧化和降低衰老氧化应激反应；也可作为化疗药物的补充剂、糖尿病保健食品和神经保护药物使用[8]。柑橘果皮多酚，可有效地防治由自由基介导的疾病如癌症、糖尿病、神经退行性疾病、衰老、心血管功能障碍等[6]，还具有广泛的生物活性包括抗菌、抗病毒、抗过敏、抗血栓、消炎和舒张血管，某些多酚具有神经保护、抗幽门螺旋杆菌的作用[8]。实验证明，三萜类具有消炎、抗溃疡、抗菌、护肝、免疫调节、降血脂、降胆固醇、抗动脉粥样硬化、促进创伤修复、抗凝血以及抗癌活性[9]，且在治疗某些癌症、炎症或真菌感染等方面可作为有前景的多靶向试剂[10]；天然富含三萜的资源，特别是源自食用和药用植物，是许多研究的热点，其中果皮中的三萜是受到较多关注[11]。目前关于柑橘果皮中天然化学产物的研究多集中在多酚和黄酮[5,8,12]，亦有柑橘果蜡三萜的报道[9]，然而关于果皮三萜的文献较少。

选取常见市售柑橘：砂糖橘、脐橙、芦柑、蜜桔四种柑橘（成熟度大小均一）为研究对象，对柑橘果皮中总多酚、总黄酮及总三萜含量进行分析，通过DPPH·、ABTS·+、羟自由基清除体外抗氧化法，对该四种柑橘果皮的抗氧化活性进行评价，同时对柑橘的活性成分及抗氧化能力进行相关性分析，为柑橘皮的加工利用和后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

砂糖橘、脐橙、芦柑、蜜桔购于宿州市家乐福超市；甲醇、乙醇、冰醋酸分析纯，无锡市亚太联合化工有限公司；氢氧化钠、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、水杨酸、Vc 分析纯，国药集团化学试剂有限公司；高氯酸分析纯，天津康科德科技有限公司；过氧化氢分析纯，东莞市泽丰化工实业有限公司；福林酚，上海蓝季科技发展有限公司；芦丁（≥98%）、熊果酸（≥98%）、没食子酸（99%）、香草醛（99%），库尔化学科技（北京）有限公司；ABTS（2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，≥98%），合肥巴斯夫生物科技有限公司；DPPH（2,2-联苯基-1-苦基肼基，≥98%），上海源叶生物科技有限公司。

722N 紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；FA-N 精密电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；KQ5200DE 超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SUS 304 干燥粉碎机（常州市益民干燥设备有限公司）；DHG-9030A 电热恒温干燥箱（上海恒一仪器有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备

柑橘皮粉末样品的制备:剥橘皮并于50 ℃烘箱中烘24 h 至干燥，粉碎过60 目筛，称取1.00 g样品，按料液比为1∶30 (g/mL) 的80%甲醇[13]在40 ℃下超声波浸提30 min，抽滤，所得滤渣重复提取两次，将3 次所得滤液合并，用80%甲醇溶剂定容到250 mL。

1.2.2 总多酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu 比色法[14]，绘制标准曲线，再进行测量。

准确称取0.100 g 没食子酸标准品，75%乙醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用75%的乙醇定容至50 mL，得到质量浓度为0.02 mg/mL 的母液备用。取6 支10 mL 比色管，加入母液，体积分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，再加入蒸馏水补足3 mL，各加入福林酚试剂1 mL 10%Na2CO3溶液6 mL，75%的乙醇定容至10 mL，30 ℃水浴锅中反应1 h，在750 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸质量浓度为横坐标，绘制并测得其标准曲线为：y=103.14x+0.008 1，R2=0.998 1。

总多酚含量测定：分别取四种柑橘果皮甲醇提取液0.5 mL 于10 mL 具塞试管中，按以上加液方法定容后测吸光度，按如下公式计算，结果以没食子酸当量表示，即mg GAE/g。

式（1）中：X 为测出的质量分数，mg/g；n 为稀释倍数；V1为样液总体积，mL；V 为测定时取样体积，mL；W 为样品质量，g。

1.2.3 总黄酮含量测定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法[15]，绘制标准曲线，再进行测量。

准确称量0.010 g 芦丁标准品，75%乙醇溶液溶解稀释并定容至100 mL，取1 mL 用75%乙醇定容至50 mL，得到质量浓度为0.002 mg/mL 的母液备用。取6 支10 mL 比色管，加入母液，体积分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，用75%乙醇补充至5 mL，混匀后，各加入0.3 mL 体积分数为5%的NaNO2，混合均匀后静置5 min，加入0.3 mL 体积分数为10%的Al(NO3)3，混匀后静置6 min 后加入4 mL 1 mol/L 的NaOH 溶液，再加入75%的乙醇定容至10 mL，混匀后静置10 min。在510 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，芦丁质量浓度(mg/mL)为横坐标，制作标准曲线。测得总黄酮标准曲线为：

总黄酮含量测定：分别取四种柑橘果皮甲醇提取液5 mL 于10 mL 具塞试管中，按上述方法定容后测吸光度，按公式（1）计算，结果以芦丁当量表示，即mg RE/g。

1.2.4 总三萜含量测定

采用香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法[16]，绘制标准曲线，再进行测量。

准确称取0.005 0 g 熊果酸标准品，置于50 mL 容量瓶中，加75%乙醇溶解并定容至刻度，得到质量浓度为100 μg/mL 母液。取6 支5 mL 比色管，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 母液，加热蒸干后加入0.8 mL 高氯酸、0.2 mL 的5%香草醛冰醋酸溶液，放在60 ℃水浴锅中反应15 min后，冷却至室温，再加入冰醋酸定容至5 mL，在548 nm 处测定吸光度。以吸光度为纵坐、熊果酸质量浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。所测得总三萜标准曲线为：

三萜含量测定：分别取四种柑橘果皮甲醇提取液5 mL 于10 mL 具塞试管中，按上述方法定容后测吸光度，按公式（1）计算，结果以熊果酸当量表示，即mg UAE/g。

1.2.5 ABTS 自由基清除能力测定

ABTS 自由基清除能力测定[17]。ABTS 溶液的制备：精确称取0.038 4 g ABTS 于10 mL 容量瓶中，用蒸馏水溶解稀释定容至刻度，将ABTS 配置成7 mmol/L 的准备液，精确称量0.013 4 g 过硫酸钾于10 mL 容量瓶中，用蒸馏水溶解稀释定容至刻度，使过硫酸钾的浓度为2.5 mmol/L，各取0.2 mL ABTS 溶液与过硫酸钾溶液混合，之后将该溶液在室温下置于暗处12 h 备用。用80%甲醇将ABTS 自由基溶液稀释，使其在734 nm 下测得的的吸光值为0.70±0.02。

ABTS.+清除率测定：

A0测定：准确取2 mL 80%甲醇+3 mL ABTS供试品混合均匀，在734 nm 处测定吸光度值。

A1测定：准确取2 mL 样品（标品）+ 3 mL 80%甲醇混合均匀，在734 nm 处测定吸光度值。

A2测定：准确取2 mL 样品（标品）+ 3 mL ABTS 供试品混合于暗处放置30 min 后，在734 nm 处测定吸光度值。

式中：A0为不加样品的标准体系吸光度；A1为不含H2O2的标准体系吸光度；A2为加入样品提取物的标准体系吸光度。

ABTS 自由基清除能力标准曲线绘制及样品测定：准确称取0.100 0 g Vc 标准品，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到质量浓度为0.04 mg/mL 的母液备用。取6 支10 mL 具塞试管，加入母液，体积分别为1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸馏水定容至刻度，按上述步骤测定吸光值，按清除率公式算出相应浓度的清除率。以Vc 质量浓度（ug/mL）为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线，根据标曲计算样品ABTS 自由基清除能力，结果以mg Vc eq./g (DW 干重)表示。所测ABTS 自由基清除能力标准曲线为y=2.567 7x+0.307 6，R2=996 3。

1.2.6 清除羟自由基能力测定

清除羟自由基能力测定[18]。羟自由基清除率的测定：标准体系中含有6.0 mmol/L H2O22.0 mL，6.0 mmol/L FeSO42.0 mL，6.0 mmol/L 水杨酸2.0 mL，分别加入样液2.0 mL。最后加入H2O2启动反应，37 ℃反应0.5 h。以甲醇作参比，在510 nm 下测吸光度A2。

羟自由基清除能力标准曲线的绘制及样品测定：准确称取0.100 g Vc 标准品，用80%甲醇溶解并定容至100 m L，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到质量浓度为0.04 mg/mL 的母液备用。取6 支10 mL 具塞试管，加入母液，体积分别为1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸馏水定容至刻度，得一定浓度梯度Vc 标品，按清除羟自由基测定的步骤得相应浓度下的吸光值，按清除率公式算出相应浓度的清除率。以Vc 质量浓度（ug/mL）为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线，根据标曲计算样品羟自由基清除能力，结果以mg Vc eq./g 表示。羟自由基清除能力标准曲线为y=0.103 8x+2.5695，R2=0.990 7。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力测定

DPPH 自由基清除能力测定[15]。DPPH 溶液的制备：精密称取0.007 80 g DPPH 标准品,用无水乙醇溶解，定容至100 mL，配制成浓度为0.2 mmol/L 储备液，于4 ℃下保存，备用。

A0 测定：准确取2 mL80%甲醇+3 mL DPPH供试品混合均匀，在517 nm 处测定吸光度值。

A1 测定：准确取2 mL 样品（标品）+3 mL80%甲醇混合均匀，在517 nm 处测定吸光度值。

A2 测定：准确取2 mL 样品（标品）+3 mL DPPH 供试品混合于暗处放置30 min 后，在517 nm 处测定吸光度值。

DPPH 自由基清除能力标准曲线的绘制及样品测定：准确称取0.100 0 g Vc 标准品，用80%甲醇溶解并定容至100 mL，取1 mL 用80%甲醇定容至25 mL，得到质量浓度为0.04 mg/mL 的母液备用。取6 支10 mL 具塞试管，加入母液，体积分别为1.25、2.50、3.75、5.00、6.25 mL，加蒸馏水定容至刻度，得浓度梯度的Vc 标品，按清除DPPH.-测定的步骤得相应浓度下的吸光值，按清除率公式算出相应浓度的清除率。以Vc 质量浓度（ug/mL）为横坐标，清除率为纵坐标，绘制并测得标准曲线为y=3.080 6 x+2.333 8，R2=0.994 8。

1.2.8 TOPSIS 综合评价柑橘果皮抗氧化能力

逼近于理想值的排序方法(technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS)数学模型综合评价柑橘果皮抗氧化能力[19]。本文采用TOPSIS 法对柑橘果皮的抗氧化能力（清除DPPH·-、ABTS·+、羟基自由基能力）进行综合评定，步骤如下。

（ⅰ）建立决策矩阵

式中：xij是第i 中柑橘果皮的第j 个抗氧化指标；m为柑橘果皮种数4，n 为抗氧化指标种数3。

（ⅱ） 归一化决策矩阵

对决策矩阵进行归一化处理以消除不同指标量纲的影响。归一化后的矩阵为

式中：Rj代表逼近度，Rj∈[0,1]。

1.2.9 数据分析

结果表示为Mean±SD，采用SPSS 22.0 进行相关性和差异性分析（P＜0.05，P＜0.01 分别为差异显著和差异极显著）。

2 结果与分析

2.1 四种柑橘果皮中活性物质含量

所测柑橘总多酚含量为16.61～40.64 mg GAE/g，其中芦柑＞蜜桔＞砂糖橘＞脐橙，芦柑、蜜桔和砂糖橘之间差异显著，砂糖橘和脐橙无显著差异。张东峰等人测定7 中柑橘果肉果皮中多酚含量，发现果皮中含量高于果肉，为24.77～47.48 mg GAE/g，与本文相近[13]。所测柑橘皮总多酚比Agarwal 等[20]所测得柠檬皮中含量高，见表1。

所测柑橘总黄酮含量为145.6～193.5 mg RE/g，其中芦柑＞蜜桔＞砂糖橘＞脐橙，差异显著。Wang 等测定了8 种柑橘果皮的总黄酮含量，为32.7～49.2 mg RE/g，比 本 文 所 测 黄 酮 稍 低[21]。Zhang 等[12]测定了国产19 种不同柑橘的果皮、果肉、种子、果汁中的总多酚和总黄酮含量，果皮中这两种物质含量最多，果皮中的总黄酮含量较本文低36%～88%，多酚含量比本文低19%～44%。

所测柑橘总三萜含量为5.46～10.83 mg RE/g，其中芦柑＞蜜桔＞砂糖橘＞脐橙，芦柑、蜜桔和脐橙之间差异显著，砂糖橘和蜜桔无显著差异。目前柑橘中的的三萜类化合物较少受到关注。Kou等[19]测定的鲜枣果的三萜为7.52～16.57 mg UAE/g与本文较为接近。

芦柑橘皮中总多酚、总黄酮和总三萜含量在所测柑橘果皮中最高，蜜桔次之。

表1 四种柑橘果皮中总多酚、总黄酮、总三萜含量

2.2 四种柑橘果皮抗氧化能力比较

本实验采用SPSS 对数据进行分析，通过DPPH·、ABTS·+、清除羟自由基的能力这3 种抗氧化测定方法研究了4 种品种柑橘果皮的抗氧化活性。不同柑橘果皮抗氧化能力比较结果见图1图中不同小写字母代表差异显著（P＜0.05）。

图1 四种柑橘果皮抗氧化能力比较

由图1 可知，不同柑果橘皮中的抗氧化活性具有显著性差异（P＜0.05）。四种柑橘皮的DPPH·抗氧化活性介于5.025～7.498 mg Vc eq./g，其中抗氧化活性最强的是芦柑果皮，其次分别为：蜜桔皮、沙糖桔皮、脐橙皮。ABTS·+的抗氧化活性介于6.40～7.98 mg Vc eq./g，其中抗氧化活性最强的是芦柑皮，其余由高到低依次是：蜜桔皮＞砂糖橘皮＞脐橙皮，与DPPH·抗氧化活性呈相同的趋势。清除羟自由基的抗氧化活性在6.78～11.32 mg Vc eq./g 之间，抗氧化活性最强的仍然是芦柑皮，其次依次为脐橙皮、蜜桔皮、砂糖橘皮；4 种柑橘中抗氧化活性最强的为芦柑皮。

2.3 橘皮抗氧化能力综合排序

TOPSIS 法综合评定可知，抗氧化能力强弱顺序为芦柑皮＞蜜桔皮＞脐橙皮＞砂糖橘皮，见表2。

表2 TOPSIS 法抗氧化能力综合排序

2.4 相关性分析

由表3 可知，3 种抗氧化活性能力测定方法中，柑橘皮的抗氧化能力（清除DPPH·、ABTS·+和羟自由基的能力）与多酚含量（r=0.958；r=0.919；r=0.735，P＜0.01）、及黄酮含量显著相关（r=0.893；r=0.873；r=0.702，P＜0.01）。不同水果中三萜和抗氧化能力呈现不同的相关性：Kou[19]等测得枣果中三萜和铁离子还原能力、DPPH·清除能力不相关，和ABTS·+清除能力呈负相关；发现三萜含量和DPPH·、ABTS·+清除能力的相关性最弱（r=0.862；r=0.848；P＜0.01），仍显著相关，但与羟基自由基清除能力不相关（r=0.434，P＜0.01）。由此可得，柑橘皮中的最主要抗氧化活性成分物质是黄酮与多酚，抗氧化能力与三萜含量也显著相关，但稍弱于多酚和黄酮。三萜和清除羟自由基无显著相关性，说明柑橘皮中的三萜可能无清除羟自由基的作用。

表3 抗氧化活性成分与抗氧化活性斯皮尔曼相关性

3 小结

不同柑橘果皮中抗氧化活性成分含量有所不同，结果表明4 种柑橘果皮的多酚含量介于16.05～40.68 mg GAE/g 之间；黄酮含量在145.2～193.2 mg RE/g 之间，三萜含量在5.39～10.88 mg UAE/g，四种柑橘果皮中总多酚、总黄酮及总三萜含量高低依次为：芦柑皮、蜜桔皮、砂糖橘皮、脐橙皮。此外，不同品种柑橘皮的抗氧化能力差异显著，且通过相关性分析可知，柑橘果皮中多酚和黄酮对抗氧化功能起着主要的作用，三萜对清除羟基自由基作用不显著。