牦牛谷胱甘肽过氧化酶1基因(GPX1)的克隆及系统发育分析

李瑞哲，徐惊涛，马志杰，孙永刚，韩银仓，陈生梅

(青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)

硒是动物机体必需的微量元素之一，在繁殖、免疫、抗氧化、调节机体代谢等生理功能中具有重要作用[1]。硒蛋白是指含有硒半胱氨酸(selenocysteine)残基的一类蛋白质，是硒发挥生物学功能的主要载体[2]。硒蛋白的特殊之处在于编码硒半胱氨酸的密码子为UGA，而在其他蛋白质中UGA一般作为终止密码子。目前为止，在哺乳动物中发现的硒蛋白已经有二十多种，主要成员包括谷胱甘肽过氧化物酶家族(glutathione peroxidase，GPxs)、硫氧还蛋白还原酶家族(thioredoxin reductases，TrxRs)、脱碘酶家族(iodothyronine deiodinases，DIOs)等[2]。谷胱甘肽过氧化酶能够催化还原H2O2和有机过氧化物，将其转变为H2O和相应的有机醇，起着抗氧化和维持细胞内氧化还原平衡的作用[3]。在哺乳动物中已经鉴定出GPx1～GPx8八个成员[4]，其中GPx1是最早被鉴定出的含硒蛋白，广泛分布于机体各类组织中，在抗氧化应激、炎症信号介导、糖和脂类代谢、卵泡发育、代谢疾病以及癌症发生等生理病理过程中起着重要作用[5-8]。

小鼠上的研究表明，在低硒饲养的条件下，GPx1的mRNA水平和蛋白表达量急剧下降[9]，提示GPx1可以作为动物硒状态的指示剂；对猪的研究表明，GPx1是猪圆环2型病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)感染过程中重要的防御因子，能够阻止PCV2的扩散[10]；对牛的研究表明，GPxs的活性与动物体内硒含量和泌乳期有关，泌乳前期的硒含量和GPxs的活性均较高[11]。在牦牛上尚未见到GPx1与生理病理过程的相关研究。因此，本试验克隆了牦牛GPX1基因的CDS区，分析了其核苷酸序列，为进一步研究牦牛GPx1的生理功能提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为实验室保存的牦牛耳缘皮肤成纤维传代细胞。

1.2 主要试剂

TRIzol试剂购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，反转录试剂盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)购自TaKaRa公司，高保真PCR试剂盒(KP203)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)，pLB零背景快速连接试剂盒(VT205)和感受态细胞(DH5α)购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 基因克隆

采用TRIzol法提取RNA，提取出的RNA采用Nanodropone测定浓度。然后采用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。参考黄牛GPX1 mRNA序列(NM_174076.3)设计引物，上游引物为5’-GGAAACGGATACCATGTGCG-3’，下游引物为5’-GGCATTCCTCCACGTAGGTT-3’。以上述cDNA为PCR模板，进行目的基因扩增。PCR反应各组分为：2×UltraHiFi Mix 25μL，上下游引物各1.25μL，DNA模板2μL，ddH2O 20.5μL。PCR反应参数为：94℃ 2min；98℃ 10s，61℃ 30s，68℃ 20s，35个循环；68℃5min。反应结束后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增情况。

采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因片段，检测浓度后与pLB载体连接；连接产物转化入DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的琼脂平板后37℃过夜培养；次日挑取单个菌落置于LB液体培养基，37℃震荡培养；经菌液PCR鉴定阳性的样品送上海生工测序。

1.4 数据分析

采用BioEdit 7.2软件进行目的基因的序列提取和ORF分析，采用DNAMAN 9.0软件进行核苷酸和氨基酸的序列一致性分析，采用MEGA 10.2软件中的Neighbor Joining法进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 牦牛GPX1基因克隆

牦牛GPX1基因PCR结果见图1。获得的目的片段与预期大小相符。

图1 牦牛GPX1基因PCR扩增结果

2.2 序列分析结果

采用BioEdit软件提取目的基因的序列信息，并进行ORF分析。经测序目的片段长度为727 bp，与预期结果相符。进行ORF分析时，由于ORF寻找程序通常将TGA识别为终止密码子，而实际上在某些mRNA中UGA编码的为硒半胱氨酸[12]，因此ORF结果需进行相应的调整。ORF分析结果表明，牦牛GPX1基因的ORF长度为618bp，编码205个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG(图2)。

图2 预测的牦牛GPX1 ORF及其编码的氨基酸序列起始密码子ATG用方框标示，终止密码子用*标示，深色背景TGA标示其编码的硒半胱氨酸

表1 牦牛与其他物种GPX1基因的CDS区和氨基酸序列一致性分析

2.3 同源性分析与系统进化树

采用DNAMAN软件将克隆获得的牦牛CDS区序列和氨基酸序列与普通牛、瘤牛、水牛、绵羊、猪、人、狗、小鼠、鸡和斑马鱼的CDS区序列和氨基酸序列进行序列一致性分析，结果见表1。牦牛GPX1基因的CDS序列和氨基酸序列与普通牛和瘤牛完全一致，与其他哺乳动物的序列一致性均超过80%。

采用MEGA软件构建牦牛GPX1基因CDS区核苷酸序列与上述几种物种GPX1基因CDS区核苷酸序列的系统进化树(图3)。牦牛首先与普通牛、瘤牛、水牛等牛亚科动物聚类，而后是羊亚科和偶蹄目动物，然后是人、狗、小鼠等哺乳类动物，与斑马鱼遗传距离最远。

图3 牦牛与其他10个物种基于GPX1基因的系统发育树

3 讨论

牦牛是生活在青藏高原及其毗邻区域的特色畜种，在漫长的进化过程中适应了高寒、缺氧的生态环境。与其近缘种普通牛相比，牦牛在基因分子序列、组织形态结构、器官生理功能等方面都表现出了对缺氧应激的适应性进化[13-15]。GPx1是第一个被鉴定出的硒蛋白，它以同四聚体的形式存在，能够以还原型谷胱甘肽等还原剂为底物，将H2O2和其他可溶性小分子量有机过氧化物还原为水和相应的有机醇，是机体重要的抗氧化酶[6]。GPX1敲除的小鼠虽然能够正常生长发育，但是其对氧化应激的抵抗能力会减弱，De Haan等[16]的研究表明10mg·kg-1的百草枯就能对GPX1-/-小鼠产生致死作用(野生型小鼠LD50约为70 mg·kg-1)，当剂量增加到30 mg·kg-1时所有的GPX1-/-小鼠会死亡，而此时对野生型小鼠尚未表现出致死效应。在人、小鼠、牛、猪等多个物种上的研究均表明GPx1与代谢、繁殖、免疫、疾病等生理病理过程密切相关，而在牦牛上尚未见到GPx1与生理病理过程的相关研究，因此本试验克隆了牦牛GPX1基因的CDS区，分析了其核苷酸序列，为进一步研究牦牛GPx1的生理功能提供基础数据。

序列同源性分析是研究物种系统发育的重要内容之一。在牦牛上目前已有多个与环境适应性和经济性状相关的基因被克隆。如段荟芹等[17]克隆了麦洼牦牛低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因，序列分析结果表明麦洼牦牛HIF-1α基因与野牦牛、牦牛、普通牛、藏羚羊、绵羊、山羊的同源性最高，均达99%，与野猪、人的同源性分别为96%、94%；系统进化树结果显示麦洼牦牛最先与牦牛、野牦牛、普通牛聚为一支，再与藏羚羊、绵羊、山羊聚为一支，最后和其他哺乳动物聚为一支。马志杰等[18]克隆了牦牛心脏脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)，序列分析结果表明牦牛H-FABP基因编码区序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡和斑马鱼的同源性大小分别为99.8%、97.8%、97.0%、92.8%、88.8%、83.3%、83.1%、76.4%和68.7%；系统进化树结果显示，牦牛与普通牛、绵羊与山羊先分别聚在一起，再与猪、人分别聚类，然后与小鼠和大鼠聚为一类，最后与鸡聚为一类。杨联等[19]克隆了牦牛生长激素基因，序列分析结果表明牦牛生长激素基因编码区序列与牛、山羊、绵羊、马、猪、猫和犬的同源性分别为99.8%、98.6%、97.7%、90.6%、90.1%、89.1%和88.9%；系统进化树结果显示，牦牛首先与牛聚类，而后与山羊和绵羊聚为一类，然后与猪聚为一类，最后与马、猫和犬聚为一类。何向东等[20]克隆了牦牛促肾上腺皮质激素释放激素基因(CRH)，序列分析结果表明牦牛CRH基因与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%；系统进化树结果显示，牦牛与黄牛首先聚为一小类，其次与猪、猫、人、小鼠和大鼠聚为一类，最后与鸡聚为一类。朱江江等[21]克隆了牦牛谷胱甘肽过氧化物酶5基因(GPX5)，序列分析结果表明牦牛GPX5基因与山羊、绵羊、家猪、家猫和仓鼠的同源性分别是95%、95%、90%、87%和86%；系统进化树结果显示，牦牛首先与山羊和绵羊聚为一类，然后先后与家猪和家猫聚类，最后与仓鼠聚为一类。本研究结果显示，牦牛GPX1基因的CDS序列和氨基酸序列与普通牛和瘤牛完全一致，与水牛和绵羊的序列一致性分别为98.9%和97.6%，与其他哺乳动物的序列一致性也都超过了80%，说明GPX1基因在哺乳动物中较为保守，在牛亚科动物间更为保守。基于GPX1基因的系统进化树的结果表明，牦牛首先与普通牛、瘤牛、水牛等牛亚科动物聚类，而后是羊亚科和偶蹄目动物，然后是人、狗、小鼠等哺乳类动物，与斑马鱼遗传距离最远，这与动物分类学上的结论也基本一致，说明GPX1基因可以作为构建物种之间系统进化树的候选基因。