索氏提取装置的改良及其在烟草挥发性成分分析中的应用

黄海涛，许 永，刘 欣，李 晶，孔维松，杨叶昆，李雪梅，杨光宇

（云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南 昆明 650106）

人的嗅觉和味觉对烟草中的挥发性成分通常比较敏感，而其中许多挥发性成分是烟草中重要的香气成分。烟草香气成分是影响卷烟产品风味形成的主要因素,也是评价卷烟品质的重要因素。因此，挥发性成分的组成和含量一直是烟草化学的重要研究内容。

目前，常用的挥发性成分提取方法有溶剂萃取 法[1]、同时蒸馏萃取法[2-4]、超临界流体萃取法[5]、固相微萃取法[2-4,6]、顶空气相色谱法[7]、吹扫捕集热脱附解吸法[8]等。在这些方法中，顶空气相色谱法、吹扫捕集热脱附解吸法因分析结果重现性较差，大多用于定性分析；同时蒸馏萃取中部分不稳定组分长时间与热水相遇会发生热分解；而溶剂萃取法因操作简单、经济实用、提取效率高等得到了广泛的应用。固体物质的溶剂萃取通常采用冷浸法或热浸法（索氏提取法），冷浸法是靠溶剂长时间的浸润溶解从而将固体物质中可溶于溶剂的成分浸提出来，而热浸法（索氏提取法）是利用溶剂回流及虹吸原理，使固体物质被纯溶剂持续提取，但在提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，影响样品分析结果，而且在提取过程中很难避免挥发性成分损失。

综上所述，现有的方法均无法满足烟草中挥发性成分准确分析和客观评价的要求。基于此，笔者对样品前处理方法进行改进，设计了一种带固相萃取功能的索氏提取装置，该装置于密闭环境进行加热萃取，集萃取、净化和浓缩为一体，中途不需要转移样品，大大简化了样品前处理操作，有效缩短了样品前处理周期。该装置为烟草中挥发性成分的提取分析提供了快速可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟叶样品为云烟87，产地玉溪。主要试验试剂有硅胶、硅钨酸、无水硫酸钠和二氯甲烷，除特殊说明外，所用试剂均为分析纯或以上级。

主要试验仪器有高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）、Agilent 6890-5973N 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）、ME414S 型电子天平（感量0.0001g，德国Sartorius 公司）、SJIA-5FE 小型视频冷冻干燥机（宁波双嘉）。

1.2 传统索氏提取装置的改良

该研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置（图1）包括如下部件：烧瓶1，烧瓶1 上设有第一接口3、第二接口4 和螺纹接口2，烧瓶1 通过第一接口3 与隔热导气管5 气流导通连接，隔热导气管5 另一端与三通转接管7 气流导通连接，三通转接管7 的另外2 个接口分别与密闭冷凝管10 和样品筒8 气流导通连接，密闭冷凝管10 上设有泄压阀11，样品筒8 远离三通转接管7 的一端设有筛板12，并与固相萃取柱9 气流导通连接，固相萃取柱9 的另一端通过溶剂回流管6 与第二接口4 气流导通连接，溶剂回流管6 内设有三通阀13；当样品处理完毕，螺纹接口2 可与样品接收尾管15 相连。

图1 带固相萃取功能的索氏提取装置结构

带固相萃取功能的索氏提取装置工作过程如下：样品分析时，于固相萃取柱9 中加入硅胶颗粒和硅钨酸，在样品筒8 中装入称量好的样品，在样品上方覆盖一层无水硫酸钠（用于除去溶剂及管道内的水分），将样品筒8 与固相萃取柱9 密封连接，在烧瓶1 中加入回流提取的溶剂（二氯甲烷），将固相萃取柱9 通过溶剂回流管6 与第二接口4 密封连接，将隔热导气管5 与第一接口3 密封连接，将三通转接管7 的3 个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10 和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10 接通冷凝水，最后将烧瓶1置于水浴锅或油浴锅中加热冷凝回流。样品提取过程中，溶剂回流管6 的三通阀13 与第二接口4 气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9 中所提取的待测样品回流至烧瓶1 中，当样品提取完毕后，把三通阀13 调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13 流出并回收，此时烧瓶1 中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，即可进行色谱检测。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理方法优化 于固相萃取柱9 内填充一定量（10、20、30、40 g）硅胶颗粒（30～60 µm）和一定量（2、5、10 g）硅钨酸，然后于样品筒8 中称取待测样品20.0 g，在样品上方覆盖一层无水硫酸钠（用于除去溶剂及管道内的水分）；将放置有样品的样品筒8 与带有固相萃取功能的索氏提取装置的其他部分密封连接；于烧瓶1中加入200 mL提取溶剂（乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷[9-10]），然后将上述装置放入50℃水浴锅中加热回流一定时间（1、2、3、4、5 h）。样品提取完毕后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1 所连接的样品接收尾管中的样品溶液蒸发至约1 mL，浓缩好的样品准确定容到5.0 mL，用0.45 µm 的针头过滤器过滤，滤液进行GC-MS 分析。

1.3.2 色谱条件优化 （1）色谱条件1：DB-5 MS 色谱 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进 样 量2.0 μL；柱流量1.0 mL/min；分流比20 ∶1；进样口温度260℃；程序升温条件为初始温度50℃保持5 min，再以3℃/min 速率升至230℃保持5 min，再以10℃/min 速率升至260℃保持20 min。（2）色谱条件2：DB-5 MS 色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样量2.0 μL；柱流量1.0 mL/min；分流比1 ∶1；进样口温度260℃；程序升温条件为初始温度50℃保持2 min，再以5℃/min 速率升至220℃，再以10℃/min 速率升至250℃保持10 min。

1.3.3 质谱条件 电子轰击离子源E1，离子化电压70 eV，离子源温度230℃，传输线温度280℃，质量扫描范围40～450 amu。

1.3.4 3 种装置提取效果的比较 采用该研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置、传统的索氏提取装置以及同时蒸馏萃取装置分别提取烟草样品中的挥发性成分，对3 种提取样品色谱图中峰面积最大的22种组分进行对比分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件的优化

2.1.1 最佳提取试剂 采用该研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置提取烟叶样品，分别用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3 种不同极性的溶剂提取，对比分析提取液的 GC-MS 总离子流图发现，3 种提取试剂中，二氯甲烷提取液中的化学成分种类最多，色谱峰面积较大，故后续研究选用二氯甲烷作为提取试剂。

2.1.2 最适提取时间 按照1.3.1 的样品前处理方法，采用带固相萃取功能的索氏提取装置分别提取烟叶样品1、2、3、4、5 h，对比分析不同提取时间得到的提取液的GC-MS 总离子流图发现，提取2 h 后，总离子流图中化学成分种类及色谱峰面积变化不大。因此，为保证目标物提取完全，后续研究选择的提取时间为2.5 h。

2.1.3 固相萃取填料的最佳用量 （1）硅胶颗粒最佳用量：索氏提取法在提取过程中大量杂质会随挥发性成分一起溶出，因此该研究对传统索氏提取装置进行了改进，于索氏提取装置中增设了固相萃取柱，采用硅胶作为固相萃取填料以吸附提取液中的极性杂质，并对硅胶的用量进行了优化。结果表明，当硅胶用量为10 g 时，提取液总离子流图中化学成分种类明显多于另外3 种硅胶用量，可能是由于硅胶用量较大时吸附了部分挥发性成分。为了实现提取液的有效净化，该研究选用10 g 硅胶对提取液中的极性杂质进行吸附。（2）硅钨酸最佳用量：在烟草挥发性成分的提取过程中烟碱会随着挥发性成分一起溶出，由于烟碱的含量明显高于其他挥发性成分，在色谱图上烟碱的色谱峰会显著影响出峰位置与其接近的部分挥发性成分的测定，因此该研究于固相萃取柱中放置硅钨酸以除去生物碱的干扰，并对硅钨酸的用量进行了优化。结果表明：当硅钨酸用量为2 g 时，提取液总离子流图中烟碱仍有明显出峰；当硅钨酸用量为5 和10 g 时，提取液总离子流图中均未出现烟碱的色谱峰；但硅钨酸用量为10 g 时，提取液总离子流图中化学成分种类少于5 g 硅钨酸用量的，可能是由于硅钨酸用量较大时吸附了部分挥发性成分。为了实现烟碱的有效吸附，该研究选用5 g 硅钨酸作为烟碱吸附剂。

2.1.4 最佳色谱条件 由表1 可知，采用色谱条件1分离得到的色谱图上烟草挥发性成分更多，色谱峰的分离度更好。

2.2 烟草挥发性成分分析

从表1 中色谱条件1 的分析数据可以看出，采用带固相萃取功能的索氏提取装置，在优化后的试验条件下对烟草样品中的挥发性成分进行分析，检测到酮类化合物16 种（包括巨豆三烯酮4 种）、醇类化合物9 种、酯类化合物9 种、烯类化合物7 种、酸类化合物6 种、醛类化合物2 种、酚类化合物2 种、其他化合物6 种。其中相对含量较高的是烯类化合物（33.95%）和酸类化合物（32.25%），随后依次是其他化合物（17.72%）、醇类化合物（11.93%）、酮类化合物（2.77%）和酯类化合物（0.98%），含量较低的是酚类化合物（0.33%）和醛类化合物（0.07%）。

表1 不同色谱条件下烟草挥发性成分分析结果

续表1

2.3 不同提取装置对烟草样品中主要挥发性成分的提取效果

从表2 可以看出，传统索氏提取装置提取液的色谱图中烟碱峰面积最大，同时蒸馏萃取装置提取液的色谱图中烟碱峰面积明显小于传统索氏提取装置，而该研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置的提取液中未检测到烟碱。由此可见，带固相萃取功能的索氏提取装置能够完全吸附提取液中的烟碱，从而有效去除烟碱对挥发性成分分析的干扰。3 种装置获得的提取液中都检测到的组分有巨豆三烯酮（A、B、C、D）、新植二烯、棕榈酸甲酯、棕榈酸和（Z,Z,Z）-9,12,15-十八碳三烯酸，而且带固相萃取功能的索氏提取装置的提取液中这几种组分的色谱峰面积均明显大于其他2 种提取装置。同时蒸馏萃取装置和带固相萃取功能的索氏提取装置提取液中都检测到的组分有2,2,4,6,6-五甲基-庚烷、香叶基香叶醇和亚麻酸甲酯，其中带固相萃取功能的索氏提取装置的提取液中这几种组分的色谱峰面积均大于同时蒸馏萃取装置的。传统索氏提取装置和带固相萃取功能的索氏提取装置提取液中都检测到的组分有3,7,11,15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇，其中带固相萃取功能的索氏提取装置的提取液中的色谱峰面积大于传统索氏提取装置。

表2 3 种装置提取烟草中主要挥发性成分的结果

此外，带固相萃取功能的索氏提取装置提取液中检出了10 种另外2 种装置未提取到的化合物，分别为苯甲醇、2-乙酰基吡咯、苯乙醇、α-松油醇、大马士酮、对甲基苯乙酮、5-羟基-3-甲基-1-茚满酮、（R）-5,6,7,7a-四氢-4,4,7a-三甲基-2（4H）-苯并呋喃酮、丙酸香茅酯和异植醇。其中大部分物质是烟草中主要的致香成分及常用的食用香精香料，例如：苯甲醇是极有用的定香剂，是茉莉、月下香、伊兰等香精调配时不可缺少的香料；2-乙酰基吡咯具有核桃、甘草、烤面包、炒榛子和鱼样的香气，可用于食用香精的调配；苯乙醇具有清甜的玫瑰样花香，主要用以配制蜂蜜、面包、桃子和浆果等类型香精，也可用于调配玫瑰花香型精油和各种花香型香精；α-松油醇具有丁香味，是调配紫丁香型香精的主剂；大马士酮具有强烈的玫瑰类似芳香，可用于高级玫瑰系列化妆品调制；对甲基苯乙酮具有类似山查子花的芳香，并有类似紫苜蓿、蜂蜜、草莓的香味，花果香味尖锐而带甜，可微量用于杏仁、香荚兰豆香型的食用香精中，还可少量用于烟草香精中；（R）-5,6,7,7a-四氢-4,4,7a-三甲基-2（4H）-苯并呋喃酮带有香豆素样香气，并有麝香样气息，可以用来调配烟用香精；丙酸香茅酯具新鲜的果香和玫瑰样香气，可用于花香型日用香精和果香型食用香精调制。

3 结论与讨论

该研究设计的带固相萃取功能的索氏提取装置可在密闭条件下对样品进行分离、提纯、浓缩，无需像传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率；此外，该装置采用全封闭的冷凝管，有效避免了提取溶剂的挥发损失，大大降低了样品前处理过程对实验室环境造成的污染；密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免了可能因压力过高对提取装置造成的损坏；该装置在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需要转移样品；该装置还设计了连接样品接收尾管接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下样品接收尾管即可定容，节省了常规浓缩烧瓶浓缩完后，需用吸管把烧瓶中的溶液取出至尾管并洗涤烧瓶和吸管的步骤；针对烟草样品中生物碱含量高的特点，该装置还针对性的设计了带硅胶和硅钨酸的复合固相萃取柱，在样品提取过程中即可在线去除生物碱和其他大极性成分的干扰，与传统的同时蒸馏萃取测定挥发性成分时需先用酸萃取洗涤除去生物碱以后再进行样品浓缩的步骤相比，该装置大大简化了样品前处理操作，缩短了样品前处理时间。

比较了带固相萃取功能的索氏提取装置、传统的索氏提取装置以及同时蒸馏萃取装置3 种提取方法，发现提取到的烟草样品挥发性成分差异较大。其中，带固相萃取功能的索氏提取装置能够完全吸附提取液中的烟碱，从而有效去除烟碱对挥发性成分分析的干扰。而且，带固相萃取功能的索氏提取装置对烟草样品中部分重要致香成分的提取效果明显优于同时蒸馏萃取装置和传统索氏提取装置。该装置的设计以及其配套提取方法的建立为烟草中挥发性成分的提取检测分析提供了快速可靠的方法。