呕吐毒素毒性及其对水产养殖影响的研究进展

刘虎,李玲,梁金荣,操玉涛,郭慧,申玉春

（广东海洋大学水产学院，湛江市海洋生态与养殖环境重点实验室，广东 湛江 524025）

呕吐毒素又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol,DON），分子式为C15H20O6，相对分子质量为296，化学名称为3,7,15-三羟基-12,13-环氧单端孢霉-9-烯-8-酮，是一种无色针状结晶，熔点151～153℃，可溶于水和极性溶剂，具有较强的热抵抗力和耐酸性，在乙酸乙酯中可长期保存[1]。DON是一种单端孢霉烯族霉菌产生的有毒次级代谢产物，是小麦、玉米等多种农作物、饲料及其原料的主要污染物。虽然它的毒性较同族其他真菌毒素小，但它广泛存在并大量污染谷物，对动物和人类危害很大，联合国粮农组织和世界卫生组织将单端孢酶烯族毒素列为最危险的自然发生食品污染物，纳入国际研究的优先地位[2]。

1 DON 的产生和污染现状

DON 的产生需要合适的温度、湿度、氧气和能量。当谷物的含水量为22%，湿度达85%左右，温度为20 ℃时,，被霉菌污染的谷物即可产生大量的DON[3]。据统计，世界上每年大约有25%的谷物受到霉菌毒素的污染，近年来的众多调查数据表明，DON 在全国以及世界范围内的粮食作物中普遍存在，且污染程度以粮谷作物种类不同而异（表1）。

2 DON 的毒性作用

DON 是由3 个分子的甲戊酸合成的倍半萜化合物，性质相当稳定，在饲料加工、储藏和运输过程中很难被降解。霉菌毒素在动物体内的代谢途径主要有三种：一是经消化道之后直接排出体外；二是通过肠道吸收后进入体循环,到达相应的靶器官进行代谢或沉积,或经泌尿系统排出体外；三是在机体的肠肝循环中被反复重吸收[18]。在已知的单端孢酶烯族毒素中，DON 的毒性虽比较弱，但它存在范围较为广泛，且检出浓度较高，对人和动物仍有很大的危害，其主要具有肠道毒性、细胞毒性、免疫毒性和神经毒性。

表1 近10 年DON 污染现状Tab.1 Researches on DON pollution in the past 10 years

2.1 肠道毒性

肠道不仅是动物吸收营养物质的主要场所，还是机体抵抗外源病原的天然屏障。动物摄食DON后主要在消化道中吸收，因此肠道是DON 毒性攻击的第一靶标。研究发现，DON 对肠道的毒性作用主要有三个方面：一是破坏肠道形态；二是损伤肠道屏障功能；三是破坏肠道微生物平衡。首先，当肠道暴露在DON 的环境中，DON 会影响肠道的形态结构。Awad 等[19]发现，DON 浓度为1 mg/kg 或5 mg/kg时，肉鸡小肠绒毛长度和吸收表面积减少。其次，肠道屏障功能主要是抵御外来病原或污染物，其中，紧密连接蛋白在肠道屏障功能中发挥着重要作用。ZO-1 蛋白是紧密结点结构的重要组成部分，在形成及维持肠道屏障的不通透性有重要作用[20]。Anderson 等[21]研究表明，DON 浓度为2 000 ng/mL 时，显著抑制ZO-1 的表达，表明DON 能够抑制紧密裂解蛋白的表达，进而破坏肠道的屏障功能。Awad 等[22]也发现，DON 主要通过改变鸡和猪肠道的TEER（跨膜上皮电阻）或Gt（经上皮的离子导电性），降低肠道细胞间离子传递和肠道细胞完整性，损伤鸡和猪的肠道屏障功能。另外，肠道微生物的平衡有助于维持肠道微生态环境的稳定，有助于肠道营养物质的吸收，并在肠道免疫方面具有重要作用[23]。Waché 等[24]研究表明，DON 能够影响肠道微生物区系的多态性，改变肠道微生物的组成、数量及分布等，影响肠道免疫，进而影响动物的生产性能。

2.2 细胞毒性

DON 有很强的细胞毒性，主要作用于动物增殖活跃的细胞，如黏膜上皮细胞和淋巴细胞。肠道黏膜上皮细胞是肠道细胞中最先接触DON 的细胞之一，也是DON 主要攻击的靶标。暴露于DON 后，猪肠道上皮细胞IPEC-1 和IPEC-J2 的数量显著减少，其增殖受到抑制，细胞停滞在G2/M 期[25,26]。当DON浓度为4 000 ng/mL 时，猪肠道上皮细胞（IPECJ2）层的TEER（跨膜上皮电阻）显著下降[27]，使肠道上皮细胞层极化、细胞通透性增强，致病分子等更易跨胞转运以及肠道微生物更易发生迁移，增加动物的易感性[28]。

淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分[29]。体外实验表明，小剂量DON（50 ng/mL、100 ng/mL）可延迟或损害CD4+T 细胞的增殖，而大剂量DON（250 ng/mL、500 ng/mL）则完全抑制CD4+T 细胞的增殖[30]。Suzuki K 等[31]研究表明，DON 可以减少CD8+T 淋巴细胞的数量，推测可能与DON 抑制蛋白质的合成或CD8+T 淋巴细胞对DON 的高敏感度有关。DON可以绑定细胞的28S 核糖体肽酰基转移酶位点，引起核糖体毒性应激反应，激活MAPKs 信号途径，介导细胞凋亡和促炎症细胞因子（如TNF-α、IL-6、COX-2 等）的表达[32,33]，引起机体的炎症反应。在炎症反应中，活性氧（ROS）可能作为信号分子，调控细胞吞噬、凋亡和基因表达等重要环节，导致免疫系统失调。DON 可以通过损伤IPEC-J2 细胞中线粒体形态和自噬体的共定位，增加细胞内活性氧（ROS）或线粒体特异性ROS 水平，且呈剂量依赖性[34]。Mishra 等[35]也通过研究表明，DON 能导致细胞内产生大量的ROS，使细胞凋亡和DNA 损伤。除此之外，DON 还可以干扰转录过程与蛋白合成，破坏细胞的形态和功能，影响细胞活性，从而引起机体过氧化损伤。Dinu 等[36]研究发现：Hek-293 细胞暴露于DON 后，细胞活性随剂量和作用时间的增加而下降，当DON 浓度为2.5 μmol/L 或5 μmol/L 时，可诱导Hek-293 细胞产生MDA，降低GSH 含量，改变抗氧酶SOD 和CAT 的活性，诱发细胞脂质过氧化作用，导致细胞死亡。

2.3 免疫毒性

研究表明，DON 既是一种免疫抑制剂,又是一种免疫促进剂，其作用与剂量和作用时间有关[37]。低浓度的DON 能够上调细胞因子、趋化因子和基因的表达，表现为免疫刺激[38]。高浓度的DON 能增加转录激活因子3（activating transcription factor 3,ATF3）的表达，增强PKR 的磷酸化，激活p38 信号途径[39]，促进机体白细胞凋亡而表现为免疫抑制[40]。一般认为，免疫抑制与抑制翻过程有关，而免疫刺激与干扰了正常的免疫调节机制有关。在体外，DON 可以诱导T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的凋亡[41]；在体内，DON 可以破坏淋巴组织，诱使肝脏、脾脏等免疫器官轻度变性，使机体免疫系统受损。李群伟等[42]通过组织病理学观察发现，家兔长期暴露于DON 时，肝脏和脾脏在内的多个脏器严重病变，主要表现为肝细胞明显肿胀，胞质内大量空泡，脾血窦扩张充血，脾小体和脾索内有炎性细胞浸润。免疫球蛋白是免疫病理结果的一种特征指标，为DON对动物免疫系统的影响提供了一种新的路径[43]。研究表明，DON 可以诱导机体内免疫球蛋白分泌紊乱[44]，包括血清中IgA 和IgE 水平的升高，循环免疫复合物IgA、肾脏系膜IgA 的沉积和血尿等。低剂量的DON 能轻微刺激机体分泌IgA，表现为免疫促进；高剂量DON 能损伤免疫细胞，降低起IgA 和IgM含量[45]。

2.4 神经毒性

研究表明，DON 能迅速通过猪和羊的血脑屏障，增加脑部不同部位去甲肾上腺素及5-羟色胺，减少多巴胺含量，降低免疫应答效应[46]，进而影响动物摄食。Hooft 等[47]给虹鳟Oncorhynchus mykiss饲喂含有DON 的饲料，发现其摄食量降低，推测与DON 对脑神经递质的影响密切相关，并指出DON对区域脑神经化学的影响可能有助于减少鱼体对DON 浓度不断增加的饲料的摄入量。Gon alves 等[48]研究发现：受DON 的影响，虹鳟脑NPY 的水平升高。NPY 及其表达水平具有直接控制摄食量的生理作用,是调节摄食行为的关键因素。Chamorro 等[49]研究表明，脑NPY 水平的升高会提高动物对饲料的摄入量，与Gonçalves 等的研究结果有所不同[48]。

3 DON 对水产养殖的影响

我国是水产养殖大国，水产动物饲料的需求量和生产居世界首位。随着植物饲料在水产动物饲料的应用日益广泛，霉菌毒素对水产动物的危害日益严重，其风险不仅来自于饲料生产过程中毒素的引入，还来自于储藏过程中毒素产量的增加。

目前，关于DON 对水产动物影响的研究主要体现在生产性能方面。Woodward 等[50]将饲料中DON 的含量从1 mg/kg 增加到13 mg/kg，发现虹鳟的摄食率明显下降；当浓度达到20 mg/kg 时，虹鳟出现拒食现象。Hendricks 等[51]的研究再次证实了这一结论。Trigostockli 等[52]的研究表明：当日粮中含有0.2 mg/kg、0.5 mg/kg 和1.0 mg/kg 的DON 时，显著降低了南美白对虾Litopenaeus vannamei 的体质量和生长速度。用DON 含量为3.7 mg/kg 的饲料养殖大西洋鲑Salmo salar 15 周后和用DON 含量为0.3～2.6 mg/kg 的饲料养殖虹鳟56 d 后，均出现摄食率和增重下降的现象[47,53]。为了验证DON 对虹鳟生长性能的影响是否只是与减少其摄食率有关，Hooft等[47]对虹鳟胴体的成分进行了分析。发现随着DON的增加，虹鳟机体粗蛋白（CP）浓度呈明显的线性下降。

另有研究表明，DON 对虹鳟生长性能的影响不仅是DON 能降低其摄食率，而是直接或间接影响其营养代谢。Pietsch[54]等研究发现：用浓度为352 μg/kg、619 μg/kg 和953 μg/kg 的DON 饲 喂 鲤Cyprinus carpio 6 周后，生长几乎未受影响，但在用最高浓度DON 饲喂的鲤的肝、头肾和脾脏中脂质过氧化反应都有所增加，整个鱼体的脂肪和能量也都有所增加，肾脏和肌肉乳酸脱氢酶（LDH）活性的变化和血清乳酸水平的升高表明：DON 能影响鲤厌氧代谢；血清白蛋白的降低可能与DON 的核毒性作用有关。

DON 除了影响动物的营养代谢，也能损伤动物免疫系统。在浓度1.4 mg/kg 或更高浓度DON 污染的饲料喂养下，组织病理学观察发现，大西洋鲑的肝脏均发生变化和损伤，包括肝细胞外观的改变、包膜下水肿和脂肪堆积[53]。Šišperová 等[55]发现，给虹鳟喂食DON 含量为2 mg/kg 的饲料一段时间后，肾脏、肝脏和鳃中的过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽过氧化酶（GPX）和谷胱甘肽转移酶（GST）活性均有明显变化。Pietsch 等[56]发现，在低剂量DON（352 μg/kg）饲料喂养的鲤体内CAT 和超氧化物歧化酶（SOD）活性升高；不同浓度DON 饲喂4 周后，鲤白细胞的促炎免疫反应均下调，但没有观察到明显的抗炎免疫反应参与。Pietsch 等[57]通过观察鲤口服DON 后先天免疫反应的过程，结果发现，鲤的免疫调节作用主要通过激活促炎细胞因子和抗炎性酶来应对DON 的急性反应，26 d 后，在鲤的头肾白细胞中检测到精氨酸酶（ARG）活性升高，表明鲤对DON 的亚慢性反应的特征是精氨酸酶的激活。Gonçalves 等[48]用含有DON 的饲料饲喂虹鳟后观察到其消化酶（主要为活性和mRNA 表达）受到影响，但无法确定这一现象是由于DON 的摄入还是因为摄食量的降低。同时，该研究还发现虹鳟体内的蛋白质、脂肪和能量的利用率显著下降，这表明DON 能影响营养物质的运输和摄取。该研究还观察到，DON 会影响虹鳟胰蛋白酶的产生，推断胰蛋白酶可能影响鱼体胰岛素的水平，从而影响其对必需氨基酸的摄取。然而，这一观点还需要进一步的研究来验证。

4 小结

近年来，随着人们对霉菌毒素关注度的提高，分子生物学技术的快速发展，对DON 的研究也越来越深入，DON 对动物的毒害作用及其机理得到了更多的阐述，但目前的研究对象大多为禽畜类，水产动物的研究还很缺少。随着植物性蛋白源替代动物性蛋白源在水产饲料中的应用，DON 对水产动物的影响也将更加严重，今后应重点研究DON 对水产动物的作用剂量、毒性机理和对机体免疫的影响以及与其他毒素之间的联合毒性等。