金蝉口服液抗呼吸道合胞病毒感染的网络药理学分析

★ 王雪 史敏（.苏州大学附属儿童医院药剂科 江苏 苏州 5003；.南京中医药大学附属苏州市中医医院/苏州市吴门医派研究院中药临床药学实验室 江苏 苏州 5009）

呼吸道 合 胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是婴幼儿急性下呼吸道感染最常见的病原体，主要病变累及毛细支气管，亦累及气管和肺泡而导致RSV肺炎。临床表现为发热、咳嗽、呼吸困难、喘憋等。目前尚无抗RSV感染的特效药物和疫苗，临床上仍以对症治疗和支持治疗为主。患儿在使用利巴韦林、干扰素、支气管扩张剂、激素类药物时，常出现发热、过敏等药物不良反应［1］。金蝉口服液是由金银花、黄芩、柴胡、蝉蜕提取物制成的中药制剂，在体内外对流感病毒具有良好的抑制作用［2］，同时对治疗小儿呼吸道合胞病毒（RSV）肺炎的有效性与安全性也得到证实，但作用机制尚不明确［3］。本文基于网络药理学的方法分析金蝉口服液抗RSV感染的作用机制，为进一步实验验证提供依据。

1 材料与方法

1.1 金蝉口服液有效成分的筛选 借助中药系统药理学分析数据库 TCMSP Version: 2.3（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），分别以“金银花”“黄芩”“柴胡”“蝉蜕”为关键词，共得到736种药物成分信息。以生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥ 30% 和类药性（Drug-likeness，DL）≥0.18以及Caco-2≥0为筛选阈值。其中蝉蜕为动物药，将查询得到8种化合物全部纳入分析。

1.2 靶点蛋白的筛选 首先将1.1中筛选到的化合物 从 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 数据库中确定活性成分的化学结构式，得到其结构的SMILES格式。基于结构相似性原则，借助Swiss Target Prediction［4］（http://www.swisstargetprediction.ch/）和 STICH［5］（http://stitch.embl.de/）数据库，获得对应化合物的潜在靶点。整理并删去重复靶点，共筛选得到22种活性化合物对应的102个靶点。通过检索疾病数据库GAD（https://geneticassociationdb.nih.gov/）和DisGeNET （http://www.disgenet.org/）数据库，输入“respiratory syncytial virus”“RSV”为关键词收集 RSV感染相关的靶基因。为便于分析，均将上述所有靶基因转化为Uniprot 数据库识别码格式。将活性化合物预测的靶基因与疾病靶基因合并取交集，筛选得到的共同的靶基因可能是金蝉口服液抗呼吸道合胞病毒感染的直接作用靶点。

1.3 靶蛋白相互作用（PPI）网络构建 STRING11.0（https://string-db.org/）数据库可以通过对蛋白质之间直接或间接的相互作用进行打分，打分值越高说明蛋白质相互作用置信度越高。将1.2中收集到金蝉口服液直接作用抗呼吸道合胞病毒感染蛋白输入到STRING11.0数据库中，物种设为“Homo sapiens”，最低相互作用选择 confidence ≥ 0.7（medium confidence），其余参数保持默认设置。网络连线的粗细代表相互作用力强弱。将互作关系数据导入Cytoscape3.2.1中作进一步分析，靶点的度值（Degree）表示相互作用的靶点个数。

1.4 基因本体（GO）分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 应用Cytoscape3.2.1软件中的ClueGo插件对收集到的共同靶基因进行GO生物过程富集分析和KEGG通路富集分析（P≤0.05），用来进一步探究金蝉口服液抗RSV感染的潜在核心通路的作用机制。

2 结果

2.1 金蝉口服液中抗RSV靶点的活性成分 将金蝉口服液中22种活性化合物对应的102个靶基因与收集到的RSV靶基因映射后，筛选得到具有抗RSV作用的直接靶点的活性成分有11种。分析发现金蝉口服液中四味药材都有贡献，其中有2种成分来自金银花：木犀草素（luteolin）和山奈酚（kaempferol），其中山奈酚为金银花和柴胡共有成分。7 种成分来自黄芩：黄芩素（Baicalein）、5，2"-二羟基-7，8-二甲氧基黄酮（Panicolin）、黄芩新素Ⅱ千层纸素 A（oroxylin a）、刺槐素（acacetin）、邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（bis［（2S）-2-ethylhexyl］benzene-1,2-dicarboxylate）、表 儿 茶 素（ent-Epicatechin）、汉黄芩素（Wogonin）；其余2种成分来自蝉蜕，见表1。

表1 金蝉口服液抗RSV有效活性成分

2.2 共同靶点的筛选及构建活性成分-靶点网络 将金蝉口服液预测靶基因与RSV感染相关疾病靶基因进行映射，得到22种共同基因确定为金蝉口服液的抗RSV感染的直接作用靶点，见表2。同时，构建活性化合物-靶点网络图结果见图1。

表2 金蝉口服液抗RSV直接作用的靶点

（续表）

注：菱形节点代表活性成分，圆形节点代表靶点蛋白。

2.3 靶蛋白相互作用（PPI）网络分析 蛋白互作网络分析显示金蝉口服液抗呼吸道合胞病毒直接作用的靶点有22个，共有114条相互作用连线。其中度值较大有degree=17的白介素6（IL6），degree=15的前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1），degree=14的有血管内皮生长因子A （VEGFA）、信号转导和转录激活因子1-α/β（STAT1）、趋化因子配体2（CCL2）、白介素10（IL10），见图2。

图2 靶点蛋白互作网络图

2.4 基因本体（GO）分析和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将金蝉口服液抗RSV直接作用的靶点导入Cytoscape 3.2.1，采用ClueGo插件进行Go生物学过程分析（P≤0.05）得到互作网络图和饼状图，结果见图3、图4，其中不同的颜色代表不同的生物学过程。主要涉及单核细胞的分化、髓系白细胞分化的正调控、免疫分子介质产生的调节以及内皮细胞和平滑肌细胞增殖的调节等，这体现了金蝉口服液可能通过调控多个复杂的生物过程产生抗RSV感染的作用。KEGG通路富集分析（P≤0.05）结果见图5、图6，其中不同的颜色代表不同的信号通路并且这些通路间存在着复杂的相互作用关系。金蝉口服液可能主要通过IL17信号通路以及Th1/Th2细胞分化信号通路来调节RSV感染过程中产生的免疫反应。

图3 ClueGO功能分析生物学过程分析互作网络图

图4 ClueGO功能分析生物学过程饼状图

图5 ClueGO KEGG通路富集分析互作网络图

图6 ClueGO KEGG通路富集分析饼状图

3 讨论

RSV属副粘病毒科肺炎病毒属的单股负链RNA病毒，其编码G蛋白和F蛋白是病毒主要保护性抗原。RSV感染后，体内先天性免疫和获得性免疫以及神经免疫机制激活，引起气道高反应性以及炎症因子的释放，导致婴幼儿毛细支气管炎、RSV肺炎，同时与哮喘发生有一定的关联性。

金蝉口服液具有疏风透表，解肌清热的功效，临床常用于流感病毒引起的呼吸道感染。本研究筛选出了复方中11种活性成分。马双成等人对金银花中抗呼吸道合胞病毒感染的黄酮类成分进行分离、结构鉴定和体外抗病毒活性实验，分离得到2种黄酮类化合物为木犀草素（MOL000006）和木犀草苷［6］。黄芩中的汉黄芩素［7］（MOL000173）、 黄芩素［8］（MOL002714）、千层纸素a［9］（MOL002928）都具有抗呼吸道合胞病毒的作用，与文献报道中相一致。此外，本研究还发现黄芩中的刺槐素（MOL001689）、表儿茶素（MOL000073）等也具有抗RSV的靶点。柴胡注射液具有显著的抑制RSV作用［10］。徐树楠等人对蝉蜕进行了药理学研究发现其具有镇咳、祛痰、平喘的作用，并推测平喘作用机制可能与抑制过敏介质的释放来发挥效应，但其有效成分尚不清楚［11］，本研究筛选出MOL011681和MOL011682推测可能为蝉蜕抗RSV的核心成分。因此，金蝉口服液4味药材在物质的基础上具有协同抗RSV病毒的作用。

本研究筛选出的金蝉口服液抗RSV的直接作用靶基因有22个。通过构建活性成分-靶点网络发现，其中PTGS2对应4种活性成分，MOL000073 和MOL000173来自黄芩， MOL011682和MOL011681来自蝉蜕； MOL001689对应6个靶基因（IL5、IL13、VEGFA、SELE、STAT1、JUN）。通过构建网络更直观的发现存在单一靶点对应多种成分，也存在单一成分对应多个靶点，体现了金蝉口服液抗RSV感染的作用多成分多靶点的作用特点。

在PPI网络中，出现频次较高的有IL6，PTGS2，MAPK1等，是整个网络的节点蛋白，说明金蝉口服液活性成分与其有较高的结合活性，可作为金蝉口服液抗RSV感染的潜在靶点。ClueGo生物功能分析显示，金蝉口服液抗RSV感染的潜在靶点与单核细胞的分化、髓系白细胞分化的正调控、免疫分子介质产生的调节以及内皮细胞和平滑肌细胞增殖的调节等多种生物学过程相关。KEGG通路富集分析发现与抗RSV有关的信号通路主要有IL17信号通路以及Th1/Th2细胞分化信号通路。IL17由辅助性T细胞（Th17）及先天性免疫细胞分泌，是一种促炎症细胞因子，在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中发挥关键作用。赵茜叶等人发现Th17及IL17可能参与RSV毛支急性期气道炎症反应过程，并与疾病的严重程度相关［12］，因此金蝉口服液可能通过IL7信号通路参与RSV感染的炎症反应过程。CD4+T淋巴细胞根据其功能分为Th1和Th2细胞。Th1细胞主要分泌IL-2，IFN-γ，TNF等参与细胞免疫及迟发型超敏性炎症的形成；Th2细胞主要分泌IL5，IL6，IL10等，主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。已有研究证实RSV感染与Th1/Th2亚群比例失衡有关，感染后Th1/Th2比值向Th2偏移［13］。因此金蝉口服液可能通过调节IL5，IL6，IL10等潜在靶点参与Th1/Th2细胞分化信号通路参与机体的免疫调节发挥抗RSV感染的作用。

本研究通过网络药理学的方法对金蝉口服液抗RSV感染的物质基础及其作用机制进行探析。发现复方中4味药材发挥协同抗RSV病毒的作用。除金银花、黄芩、柴胡外，蝉蜕作为动物药，筛选出2种抗RSV核心成分。本文从更深层次的分子生物学角度筛选出复方抗RSV的核心靶基因。靶基因参与多种生物学过程或通路大多与炎性细胞因子的分泌或者炎性介质信号通路有关，因此，金蝉口服液可能通过抑制病毒感染过程中产生的促炎因子以及相关信号转导参与抗RSV感染的作用。中药复方具有多成分、多靶点、多途径治疗疾病的特点，本研究为其他中药复方抗RSV感染提供思路借鉴。然而，网络药理学无论从数据挖掘以及靶点预测均存在诸多不足，筛选出的靶点及通路尚需进一步计算分析及实验验证。