点击化学法合成柚皮素1,2,3-三氮唑衍生物*

庞 杰 ,袁海燕,刘志平 ,黄燕敏,展军颜

(1.南宁师范大学 化学与材料学院,广西 南宁 530001；2.广西医科大学 药学院,广西 南宁 530021)

0 引言

三氮唑是一类含3个氮原子的五元杂环，具有抑菌、抗过敏、抗HIV病毒、抗肿瘤、抗结核等生物活性作用。从2001年K.Barry Sharpless等[1]提出点击化学(Click Chemistry)用于快速选择性反应以形成具有杂原子链(C-X-C)的生理稳定产物的反应以来，点击化学已成为一种快速、高效的构建1,2,3-三氮唑的新方法，在药物设计及合成中得到广泛应用。如具有抗肿瘤作用的药用分子羧胺三唑(carboxyamidotriazole)[2]和头孢曲嗪(cefatrizine)[3]均含有1,2,3-三氮唑的骨架。

carboxyamidotriazole和cefatrizine化学结构式和含三氮唑黄酮醇结构

近年来，以天然活性物质为先导化合物，在骨架上引入不同类型三氮唑基团，探讨其构效关系的的研究屡见不鲜。如Shaoru Wang[4]等合成的新型蒽醌三氮唑衍生物能促进胃癌细胞BGC的凋亡；栾天[5]等合成的三唑类白杨素衍生物比阳性对照药 5-人乳腺癌MCF-7及人卵巢癌OVCAR-3均具有显著的抑制活性，部分化合物的半抑制浓度(IC50)小于3.0μM。由此可见,将三氮唑引入母体分子可以改变母体分子的药代动力学性能和溶解性，增强母体分子的生物活性。

沙田柚是广西重要的水果资源，柚皮中富含约6%的柚皮苷。柚皮苷属于二氢黄酮类天然物质，具有镇静、降血脂、抗氧化、抗真菌、抗动脉粥样硬化等多种生物活性[7]。笔者的课题组前期的研究将柚皮苷水解后引入含氮的肟基或腙基能显著提高底物的抗肿瘤活性[8,9]。本研究仍以柚皮苷为原料，酸水解后得到柚皮素，然后利用高效的点击化学方法，合成了单三氮唑取代和双三氮唑取代的两类柚皮素衍生物，对进一步探索三氮唑结构对二氢黄酮活性的构效关系具有重要的意义。合成路线为：

Reagents and conditions: (i)H2SO4/EtOH, refiux, 8 h；(ii)propargyl bromide+ K2CO3/Atetone, 60℃;(iii)RCH2N3+CuSO45H2O+ sodium ascorbate /DMF, 90℃;柚皮素1,2,3-三氮唑衍生物的合成路线

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Bruker Avance-300型核磁共振仪测定(TMS为内标)，Waters Xevo G2 QT质谱仪，X-4显微熔点测定仪(温度计未经校正)；BS200S电子天平，实验试剂均为分析纯。

2.2 实验方法

2.2.1 柚皮素2的制备

柚皮素2的合成参照文献[8]，产率82%。

2.2.2 7-O-炔丙基柚皮素(3)和7,4’-O-二炔丙基柚皮素(4)的制备

将2.72 g (0.01 mol)柚皮素、2.07 g (0.015 mol)无水K2CO3溶入35 mL丙酮中，室温搅拌10 min后滴入1.2 mL (0.013 mol)溴丙炔，升温60℃反应2 h至原料点消失。将反应液倾入200 mL冷水中冷藏过夜，抽滤得白色固体粉末。硅胶柱层析分离(V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1)得到2.10 g化合物3和0.42 g化合物4，产率分别为68%和12%。按照同样操作方法，提高溴丙炔的添加量为2.6 mL(0.03 mol)反应6小时，柱层析分离得化合物30.46g，和化合物42.54g，产率分别为15%和73%。

化合物：白色固体, m.p.131～136℃.1H NMR (300MHz, CDCl3): δ 2.59(1H, s, ≡CH), 2.81(1H, dd,J=17.1, 2.7Hz, 3-Hc), 3.12(1H, dd,J=17.1, 13.2Hz, 3-Hb), 4.70 (2H, s, OCH2), 5.38(1H, dd,J=13.2, 3.0Hz, 2-H), 5.45(1H, s, 4-OH), 6.14(1H, d,J=2.1Hz, 6-H), 6.19(1H, d,J=2.1Hz, 8-H), 6.91(2H, d,J=8.4Hz, 3′, 5′-H), 7.35(2H, d,J=8.4Hz, 2′, 6′-H), 12.02 (1H, s, 5-OH);13C NMR (75MHz, CDCl3):δ196.3, 165.8, 164.0, 162.9, 156.3, 130.3, 128.0, 128.0, 115.7, 103.6, 95.9, 94.9, 79.0, 77.4, 76.5, 56.0, 43.2(3-C). HR-MS(ESI)m/z: 311.0901[M+H]+, (calculated for C18H15O5311.0920).

化合物4：白色固体, m.p.107～110℃.1H NMR (300MHz, CDCl3):δ2.56(1H, s, ≡CH), 2.59(1H, s, ≡CH), 2.81(1H, dd,J=17.1,3.0Hz, 3-Hc), 3.12(1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hb), 4.70 (2H, s, OCH2), 4.74(2H, s, OCH2), 5.40(1H, dd,J=12.9, 2.7Hz, 2-H), 6.13(1H, dd,J=2.1Hz, 6-H), 6.16(1H, dd,J=2.1Hz, 8-H), 7.05 (2H, d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.42(2H, d,J=8.7Hz, 2′, 6′-H), 12.02(1H, s, 5-OH),13H NMR(75MHz, CDCl3):δ196.1, 165.7, 164.0, 162,8, 157.9, 131.2, 127.7, 127.7, 115.2,115.2, 103.6, 95.9, 94.9, 78.9, 78.3, 77.4, 76.5, 75.8, 56.0, 55.9, 43.2. HR-MS(ESI)m/z: 349.1091[M+H]+, (calculated for C21H17O5349.1076)。

2.2.3 7-O-(1,2,3-三氮唑-4-亚甲氧基)白杨素(3a～3d)的制备

称取0.3 g(0.1 mmol)化合物2，0.075g (0.3 mmol) CuSO45H2O及0.12 g(0.6 mmol)抗坏血酸钠溶入15 mL DMF中，再加入1.15 mmol不同结构的叠氮化物，在90℃的温度下搅拌回流6h。反应液冷却后加适量水并用乙酸乙酯萃取(10 mL×3次)，合并有机层，用无水硫酸镁干燥，减压去除溶剂，硅胶柱层析分离 (V石油醚:V乙酸乙酯=3:1)得化合物3a～3d。

化合物3a：产率72%, m.p.84～88℃.1HNMR (300MHz, C3D6O):δ2.63(1H, dd,J=17.1Hz, 3.0, 3-Hc), 3.08(1H, dd,J=17.1, 12.6Hz, 3-Hb), 5.10 (2H, s, NCH2), 5.34(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 5.52 (2H, s, OCH2), 6.02 (2H, d,J=2.7 Hz, 6, 8-H), 6.77(2H, d,J=2.8 Hz, 3′, 5′-H), 7.27 (7H, s, ArH), 8.09(1H, s, =CH), 8.74(1H, s, 4′-OH), 11.99 (1H, s, 5-OH);13HNMR (75MHz, C3D6O):δ196.8, 166.6, 164.0, 163.3, 157.9,142.8, 136.0, 129.7, 128.8, 128.8, 128.3, 128.1, 128.1, 124.1, 115.3, 115.3, 103.0, 95.3, 94.4, 79.2, 61.9, 53.4, 42.6. HR-MS (ESI) m/z: 444.1553[M+H]+, (calculated for C25H22N3O5444.1559).

化合物3b：产率69%, m.p.97～103℃.1HNMR (300MHz, C3D6O):δ2.77 (1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hc), 3.22(1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hb), 5.25(2H, s, NCH2), 5.46(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 5.68(2H, s, OCH2), 6.16(1H, d,J=2.4Hz, 6-H), 6.17(1H, d,J=2.4Hz, 8-H), 6.91(2H, d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.40 (6H, m, Ar-H), 8.16(1H, s, =CH), 8.74(1H, s, 4′-OH), 12.13(1H, s, 5-OH);13CNMR (75MHz,C3D6O):δ196.8, 166.6, 164.0, 162.0, 157.9, 142.9, 134.9, 133.1, 129.9, 129.9, 129.7, 128.8, 128.8, 128.2, 128.2, 124.2, 115.3, 115.3, 103.1, 95.4, 94.4, 79.2, 61.9, 52.6, 42.6. HR-MS(ESI)m/z: 478.1165 [M+H]+, (calculated for C25H21ClN3O5478.1170).

化合物3c：产率95%, m.p.153～158℃.1HNMR (300MHz, C3D6O): δ1.26 (3H, d,J=7.2Hz, CH3), 2.77(1H, dd,J =17.1, 3.0Hz, 3-Hc), 3.24(1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hb), 4.23(2H, q,J=7.2Hz, OCH2), 5.29(2H, s, NCH2), 5.39(2H, s, OCH2), 5.50(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 6.19(2H, d,J=2.1Hz, 6,8-H), 6.91(2H, d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.41(2H, d,J=8.4, 2′, 6′-H), 8.19(1H, s, =CH), 8.69 (1H, s, 4-OH), 12.16(1H, s, 5-OH);13CNMR (75MHz, C3D6O):δ196.9, 166.9, 166.6, 164.1, 163.3, 157.9, 142.6, 129.7, 128.2, 128.2, 125.6, 115.3, 115.3,103.0, 95.3, 94.4, 79.2, 61.6, 61.8, 50.5, 42.6, 13.5. HR-MS (ESI)m/z: 444.1494[M+H]+, (calculated for C22H22N3O7440.1458).

化合物3d：产率70%, m.p.180～184℃.1HNMR(300MHz, C3D6O):δ2.78(1H, dd,J=17.1, 2.7Hz, 3-Hc), 3.24(1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hb), 5.33(2H, s, N-CH2), 5.50(1H, dd,J=12.9, 2.7Hz, 2-H), 6.21～6.22 (3H, m, Ar-H), 6.92 (2H, d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.42 (2H, d,J=8.4Hz, 2′, 6′-H), 7.59～7.74 (3H, m, Ar-H), 8.15(1H, s, Ar-H),8.19(1H, s, =CH), 8.66(1H, s, 4-OH), 12.16(1H, s, 5-OH);13HNMR (75MHz, C3D6O): δ 196.8, 191.3, 166.73, 164.1, 163.3, 157.9, 142.5, 134.5, 134.1, 129.7, 129.0, 129.0, 128.2, 128.2, 128.1, 128.1, 126.0, 115.3, 103.1, 95.4, 94.4, 79.2, 62.0, 55.7, 42.6. HR-MS(ESI)m/z: 472.1502[M+H]+, (calculated for C26H22N3O6472.1509).

2.2.4 7,4′-O-二炔丙基柚皮素(4a～4c)的制备

称取0.35(0.1 mmol)化合物4，0.13 g(0.52 mmol) CuSO4·5H2O，0.263 g(1.33mmol)抗坏血酸钠溶入15 mL DMF中，加入3 mmol不同结构的叠氮化物，在90℃的温度下搅拌回流12h。反应液冷却后加适量水并用乙酸乙酯萃取(15 mL×3次)，合并有机层，用无水硫酸镁干燥，减压去除溶剂，硅胶柱层析分离 (V石油醚:V乙酸乙酯=2:1)得化合物4a～4d。

化合物4a：产率67%, m.p.106～110℃.1HNMR (300MHz, C3D6O):δ2.75(1H, dd,J=17.1, 3.0Hz, 3-Hc), 3.20(1H, dd,J=17.4, 12.9Hz, 3-Hb),5.20 (2H, s, NCH2), 5.22(2H, s, NCH2), 5.50(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 5.64(4H, s, OCH2*2), 6.14(1H, dd,J=2.1Hz, 6-H), 6.16(1H, d,J=2.4Hz, 8-H), 7.08(2H, d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.31～7.37(10H, m, Ar-H), 7.47(1H, d,J=8.7Hz, 2′, 6′-H), 8.09(1H, s, =CH), 8.12(1H, s, =CH), 12.12(1H, s, 5-OH);13C NMR (75MHz, C3D6O):δ196.7, 166.6, 164.0, 163.2, 158.8, 143.7, 142.8, 136.1, 136.0, 131.3, 128.8, 128.8, 128.3, 128.3, 128.1, 128.1, 128.0, 128.0, 124.2, 123.8, 114.8, 114.8, 103.0, 95.4, 94.4, 78.9, 61.9, 61.6, 53.4, 53.3, 42.5. HR-MS(ESI)m/s: 615.2382[M+H]+, (calculated for C35H31N6O5615.2356)

化合物4b：产率71%, m.p.158～162℃.1HNMR(300MHz, C3D6O):δ2.82(1H, dd,J=17.1, 3.0Hz, 3-Hc), 3.23(1H, dd,J=17.1, 12.6Hz, 3-Hb), 5.23(2H, s, NCH2), 5.25(2H, s, NCH2), 5.53(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 5.68(4H, s, OCH2*2), 6.17(2H, d,J=3.0Hz, 6, 8-H), 7.50(2H, d,J=8.7Hz, 2′, 6′-H), 7.42～7.45(8H, m, Ar-H), 8.13(1H, s, =CH), 8.17(1H, s, =CH), 12.13(1H, s, 5-OH);13HNMR(75MHz, C3D6O):δ196.6, 166.6, 164.0, 163.2, 158.9, 143.8, 142.9, 135.0, 134.9, 133.7, 133.6, 131.3, 129.9,129.9, 129.9, 129.9, 129.8, 129.8, 129.8, 129.8, 128.7, 128.7, 124.2, 123.9, 114.8, 114.8, 103.1, 95.4, 94.4, 78.9, 61.9, 61.6, 52.6, 52.6, 42.6. HR-MS(ESI)m/z: 682.1584[M+H]+, (calculated for C35H28Cl2N6O5683.1576).

化合物4c：产率74%, m.p.141～143℃.1HNMR(300MHz, C3D6O):δ1.27 (6H, t,J= 6.9Hz, CH3), 2,81(2H, dd,J=17.1, 3.0Hz, 3-Hc), 3.25(1H, dd,J=17.1, 12.9Hz, 3-Hb), 4.24(4H, q,J=6.9Hz, OCH2*2), 5.26(2H, s,NCH2), 5.29(2H, s,NCH2), 5.39(4H, s, OCH2*2), 5.55(1H, dd,J=12.9, 3.0Hz, 2-H), 6.20(1H, d,J=2.1Hz, 6-H), 6.22(1H, d,J=2.4Hz, 8-H), 7.14(2H,d,J=8.7Hz, 3′, 5′-H), 7.52(2H, d,J=8.7Hz, 2′, 6′-H), 8.17(1H, s, =CH), 8.20(1H, s, =CH), 12.15(1H, s, 5-OH);13CNMR(75MHz, C3D6O):δ196.7, 166.9, 166.9, 166.7, 164.1, 163.2, 158.9, 143.44(10-C), 142.6, 131.3, 128.1, 128.1, 125.7, 125.3, 114.8, 114.8, 103.1, 95.4, 94.4, 79.0, 61.9, 61.6, 61.6, 61.5, 50.5, 50.5, 42.6, 13.5, 13.5. HR-MS(ESI) m/s: 607.2119[M+H]+, (calculated for C29H31N6O9607.2153).

3 结果与讨论

广西容县沙田柚种植1.4万hm2，年产沙田柚22万t。沙田柚柚皮中含有6%～7%的柚皮苷，属于天然二氢黄酮糖苷，具有的抗氧化、抗肿瘤、低毒性等特点。柚皮苷在醇溶液中用浓硫酸水解、重结晶纯化，以高产率82%得到柚皮素。利用柚皮素酸性“7-位酚羟基>4′位酚羟基>5-位酚羟基”的性质，控制溴丙炔的用量，可选择性在柚皮素7位引入炔丙基或在柚皮素7，4′位同时引入双取代的炔丙基。化合物3在1H NMRδ4.70 (2H, s, OCH2), 2.59 (1H, s, ≡CH)出现炔丙基吸收峰；化合物4在1H NMRδ2.56(1H, s, ≡CH), 2.59(1H, s, ≡CH), 4.70 (2H, s, OCH2), 4.74(2H, s, OCH2)出现两个炔丙基吸收峰，证实了化合物3和4的结构。

应用click反应原理，以单炔丙基取代柚皮素3和双炔丙基取代柚皮素4分别与含有不同基团的叠氮化合物在五水硫酸铜及抗血酸钠作用下通过点击化学法高效合成了新型的含1,2,3-三氮唑柚皮素衍生物。叠氮化物筛选了苄基叠氮、叠氮苯乙酮、叠氮乙酸乙酯三种结构，均能与炔有效发生click环加成反应，产率大于70%。合成中帅选了不同温度对click的影响，发现50～90℃内搅拌反应均能得到产物，但提高温度对缩短反应时间有较大的促进作用。三氮唑中为碱性结构，在萃取中调节水溶液为弱碱性后，再用乙酸乙酯萃取效果更好。化合物3a～3d1HNMR中δ8.09，8.16，8.19，8.19处分别出现了三氮唑环上不饱和氢单峰信号，δ5.10，5.25，5.29，5.33分别出现峰面积为2H的NCH2的单峰信号，证实了化合物3a～3d中均形成了三氮唑环。化合物4a1HNMR中δ5.20，5.22出现两个NCH2的单峰信号,δ8.09，8.12出现2个三氮唑环上不饱和氢单峰信号证实已环化形成两个1,2,3-三氮唑环；化合物4b1HNMR中δ5.23，5.25，8.13，8.17出现2个三氮唑环信号；化合物4c1HNMR中δ5.26，5.29，8.17，8.20也出现2个三氮唑环信号；证实了4a～4c均为双三氮唑取代柚皮素。

4 结论

从柚皮苷出发，通过酸水解、溴丙炔醚化、点击化学合成了7个1,2,3-三氮唑环的柚皮素衍生物。以五水硫酸铜和抗坏血酸钠催化的click chemistry环化反应条件要求低，操作简易，原子转化率高，为环境友好型的构建1,2,3-三氮唑杂环的便捷合成方法。所合成的不同位置取代的三氮唑柚皮素衍生物的抗肿瘤活性有待更深一步的测试。