固相萃取- 超高效液相色谱- 串联质谱法测定地表水中5 种磺胺类抗生素

付晓燕

（辽宁省大连生态环境监测中心，辽宁大连 116023）

1 引言

磺胺类抗生素是一种被广泛应用于医学、畜牧业和水产养殖业的抗菌药物，特点是高水溶性、低螯合能力，施用于动物后大部分会以原药或代谢物的形式，经动物粪便和尿液排出并最终进入环境，从而对环境水体造成严重污染［1-3］。其在环境中的残留和长期存在，胁迫微生物产生耐药性，并可能通过基因水平转移方式传递到其他菌群，进一步通过食物链传递到人体，威胁人类生命安全。由于磺胺类药物具有较强的极性及在环境样品中含量低的特点，导致对其分析检测难度增加［4-5］。

目前磺胺类抗生素的检测方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）、微生物检测法以及TTC 法等，但技术面向对象主要是食品药品行业，环境水体中磺胺类抗生素的检测技术很少［6-7］，而且这些检测方法对应的前处理方法用时久，操作复杂，且耗费大量有机溶剂。为了简化前处理程序，提高工作效率，本研究采用固相萃取-超高效液相色谱-串联四极杆质谱技术，建立了水质磺胺类抗生素的检测方法。该方法高效、准确、灵敏度高，能够为水质磺胺类抗生素的监测工作和饮用水的质量控制提供科学依据与技术支持。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

仪器：ACQUITY UPLC 超高效液相色谱仪，Waters TQ Detector 新型离子源加热型质谱仪；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；Milli-Q 超纯水器；固相萃取柱，填料为二乙烯苯和N-乙烯基吡咯烷酮共聚物；0.22 μm 有机相针筒式微孔滤膜过滤器，材质为玻璃纤维、亲水性聚丙烯、亲水性聚四氟乙烯（PTFE）等。

试剂：甲醇为HPLC 级（美国J. T. Baker 公司）；甲酸为HPLC 级（美国Sigma 公司）；实验用水为经Milli-Q 净化系统制备的超纯水（经0.22 μm 过滤膜）；氮气、氩气（纯度≥99.999%）；其他试剂均为分析纯；磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲唑及磺胺甲基嘧啶-13C6标准物质，纯度均≥99%（百灵威公司）。

2.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流动相为甲醇-0.1%的甲酸水溶液（梯度洗脱条件见表1）；流速0.2 mL/min；柱温40 ℃；进样量10 μL。

表1 液相色谱流动相线性梯度洗脱程序

2.3 质谱条件

电离方式为电喷雾电离ESI+，检测方式为多反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）方式，利用保留时间和碎片信号比值判断定性结果；电喷雾电压3 kV；离子源温度120 ℃；去溶剂温度350 ℃。具体质谱分析参数见表2。

2.4 样品制备

取水样100 mL，经0.45 μm 滤膜减压过滤。采用HLB 固相萃取柱萃取。分别用10 mL 甲醇、10 mL超纯水活化HLB 萃取柱。将水样以小于5 mL/min 的流速通过固相萃取柱，上样完毕后，用10 mL 超纯水淋洗小柱，再用氮气吹干小柱，之后用10 mL 甲醇洗脱富集后的固相萃取柱，并用接收管接收甲醇洗脱液，氮吹浓缩至近干，加甲酸溶液定容至1.0 mL，最后加入内标使用液10.0 μL，经0.22 μm 滤膜过滤，置于进样瓶中，等待进样。

3 结果与讨论

3.1 液相色谱条件的优化

磺胺类抗生素分子具有较强的极性，在大部分反相色谱柱上，即使以纯水做流动相，依然只有很弱的保留［5］，因此选择合适的色谱柱对磺胺类抗生素的分析测定至关重要。本研究结果表明，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色谱柱对目标物具有最佳的色谱分离效果，且在10 min 内目标物完全分离。流动相的组成不仅影响目标化合物的色谱峰形和分离效果，还会影响其离子化效率和质谱检测灵敏度。本研究考察了不同比例有机相（30%，50%及60%）的分离效果，最终确认甲醇-水（30∶70，V/V）为主要洗脱梯度，含0.1%的甲酸体系，具有最佳的电离效果和质谱特征。

3.2 质谱条件的优化

根据磺胺类抗生素分子结构的特征和化学电离性质，实验选择了ESI+作为离子化模式。为了获得最佳的灵敏度和分离效果，首先采用连续直接进样，扫描范围为m/z 10～300，分别对电喷雾电压、离子源温度、去溶剂温度、锥孔电压、碰撞电压等条件进行优化，使调谐液中磺胺类抗生素的离子化效率达到最佳。磺胺类抗生素和内标物的总离子流图见图1。

图1 磺胺类抗生素和内标物的总离子流图

3.3 检出限和标准曲线的线性范围

在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，磺胺类抗生素质量浓度为5.0～100.0 μg/L 时，峰面积和浓度呈良好的线性关系，磺胺类抗生素的线性方程及线性相关系数r 见表3。配制估测值浓度的实验室空白加标平行样7 个，按样品分析全过程进行分析测定，计算标准偏差，根据MDL＝t（n-1，0.99）×S 计算，本方法磺胺类抗生素的检出限见表3。

表3 5 种磺胺类抗生素的线性方程、回收率和精密度

3.4 加标回收率和精密度

以经测定不含有磺胺类抗生素的碧流河水库水为基质，添加高（5.0 μg/L）、中（20.0 μg/L）、低（100.0 μg/L）3 个不同浓度的标准溶液，按优化完成的实验条件，每个添加浓度重复6 次，分别进行加标回收率和精密度的测定，测定结果见表3。

4 结论

本方法建立了固相萃取-超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪对水中5 种磺胺类抗生素的快速分析方法，着重研究了超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪对水中5 种磺胺类抗生素的快速测定。该方法通过固相萃取法进样分析，节省了水样前处理过程中需要消耗的大量有机溶剂及衍生试剂，并缩短了检测时间，方法检测限低至0.009 μg/L，是一种分析速度快、定性准确、灵敏度高、稳定性好的分析方法，能够满足《国务院关于印发水污染防治行动计划的通知》（国发〔2015〕17 号）中限制使用抗生素等化学药品开展专项整治的需要，可用于水中磺胺类抗生素的监测和环境质量控制工作，可进一步推广使用。