畲药苦爹菜增强免疫力功能的活性部位筛选

2021-03-19黄刚王华富刘丽仙桂志红朱美晓

浙江临床医学 2021年2期

黄刚王华富* 刘丽仙桂志红朱美晓

畲药，主要分布在浙江省景宁畲族自治县以及福建、江西等省的部分山区，目前已发现畲药在白血病等疾病有良好的疗效，苦爹菜作为一味重要畲药，在畲药家族中有着巨大的贡献，其为伞形科茴芹属植物异叶茴芹Pimpinella diversifolia DC.的全草［1］。本研究团队前期研究结果显示畲药苦爹菜研磨液可显著提高脾淋巴细胞增殖能力及T 淋巴细胞亚群的水平，提高血清IL-2、IL-6 和TNF-α 分泌水平，本文在前期研究基础上对畲药苦爹菜的不同提取部位增强免疫力功能进行研究，以期为苦爹菜生物活性成分的研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 实验动物健康的雄性昆明系小白鼠，为SPF 级，年龄6～8 周，体重20～24 g，购置于湖北省疾病预防控制中心，饲养于武汉华联科生物技术有限公司［实验动物许可证号：SYXK（鄂）2018-0104］，小鼠在20～28℃条件下用标准鼠料及蒸馏水进行饲养。鼠笼清洁1～2 次/周。鼠笼用84 消毒液进行常规消毒。控制饲养房室温在（24±26）℃，相对湿度40%～70%，音响＜60 dB，明暗周期12 h，24 h 通风换气。

1.2 试剂和仪器苦爹菜，18 kg，由浙江省丽水市药检所李水福主任中药师/教授鉴定，采自浙江省景宁畲族自治县，自然阴干，经剪碎后用95%乙醇加热回流提取3 次，2 h/次，过滤，回收溶剂，得321 g 总膏。总膏粗提物加适量水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液浓缩成浸膏得石油醚部位48 g，乙酸乙酯部位38 g，正丁醇部位85 g，水部位159 g。总膏及各极性部位均匀溶解或悬浮于蒸馏水，均配制成折合生药材浓度约为1 g/ml 的溶液备用。环磷酰胺（100 mg），上海麦克林科技有限公司（批号：C10176816）；MTT 细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒［江苏凯基生物技术股份有限公司（批号：20180419）］；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒［碧云天生物技术有限公司（批号：C0016）］；Elisa 试剂盒（南京建成生物优先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP；单抗（美国BioLegend 公司），酶标仪（美国Thermo 公司，型号为Multuskan Go 1510），显微镜（Olympusix71，德国徕卡公司），流式细胞仪（FASCC，美国BD 公司）。

1.3 实验方法（1）造模：选取健康的SPF 级小鼠100只，其中8 只为正常组，92 只经腹腔注射35%乙醇溶解的环磷酰胺50 mg/kg 进行造模，每隔1 天注射1 次，总共注射3 次，注射前用络合碘进行常规消毒，注射完毕后观察小鼠的活动情况及死亡情况。（2）模型评判：定期观察小鼠的日常生活症状，当模型组渐渐出现行动迟缓、食欲不振、毛发松散且无光泽等症状时，可以判断免疫缺陷动物模型初步成功；并在末次注射2 天后处死模型组小鼠与正常组小鼠及模型组小鼠各10 只，检测胸腺及脾脏脏器重量指数，外周血T 淋巴细胞亚群百分比。与正常组及溶液组比较，模型组T 淋巴细胞亚群比率下降，并且脾脏、胸腺脏器重量指数下降可以判断免疫缺陷动物模型成立。（3）分组和给药：选取健康的SPF 级小鼠100 只，其中8 只为正常组，92 只经腹腔注射35%乙醇溶解的环孢菌素A 25 mg/kg 进行造模，每隔1 天注射1 次，总共注射3 次，并选取造模成功的48 只，随机选取8 只设为模型组，剩余40 只将其按照随机数字法随机分为A（总浸膏组）、B（石油醚部位组）、C（乙酸乙酯部位组）、D（正丁醇部位组）、E（水部位组）五组，均给予折合生药材2 g/kg 进行灌胃，以上药物均给药14 d，模型组和正常组给予生理盐水0.2 ml 只进行灌胃，14 d 后分别检测细胞免疫和体液免疫的相关指标。

1.4 检测指标（1）一般情况：观察并记录小鼠每天的饮水量、食量及体重，实验期间是否掉毛，被毛的光泽度，活动度，灵敏度等一般情况。（2）脾脏、胸腺指数的计算：所有动物均末次给药后1 h 腹主动脉取血，制备含药血清，-70 ℃冰箱保存备用，断颈处死小鼠，无菌条件下分离脾脏、胸腺。脾脏指数=脾脏质量/小鼠的体重；胸腺指数=胸腺质量/小鼠体重。（3）脾脏提取淋巴细胞：无菌条件下得到的小鼠脾脏，剔除脂肪、结缔组织后用无菌手术剪剪成小块，然后研钵中研磨，加入3 ml 的0.9%氯化钠溶液后过滤，将过滤液1500 r/min 离心5 min，加入3 倍体积的红细胞裂解液后重新混悬，离心后弃上清液得到沉淀细胞，用PBS 重悬后调整细胞密度为2×106/ml。（4）MTT 法检测小鼠脾淋巴细胞增殖能力：吸取100 μl 细胞悬液接种于96 孔板，每份样品设6 个复孔，前3 个孔分别加入50 μl ConA（终浓度为5 mg/L），后3 个孔为对照孔，每孔加入50 μl 的RPMI-1640 培养液。置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养72 h。培养结束前4 h，将5×MTT 用Dilution Buffer 稀释成1×MTT，每孔加入50 μl 1×MTT，于37℃、5% CO2细胞培养箱继续孵育4 h，使MTT 还原为甲臜。培养结束后，1500 r/min 离心5 min，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇10 min，在570 nm 波长处检测每孔的光密度。淋巴细胞增殖能力=试验孔OD570 值/对照孔OD570 均值。（5）吞噬功能测定：小鼠腹腔注入20%（V ∶V）生理盐水配制鸡红细胞悬液1 ml。30 min 后，颈椎脱臼处死，经腹腔注射生理盐水2 ml，取腹腔洗液1 ml 涂片，置37 ℃恒温30 min，然后漂洗，晾干，以1 ∶1 丙酮甲醇溶液固定，4%（V ∶V）Ciemsa-磷酸缓冲液染色3 min，光镜下观察。吞噬百分率（%）=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数）×100；吞噬指数=被吞噬鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。（6）T淋巴细胞百分比比较：研磨脾脏，制成细胞悬液备用，用磷酸盐缓冲液（PBS）调整细胞浓度为1×107个/ml。取100 μl 脾脏、胸腺细胞悬液，均加入FITC 标记的小鼠CD4 抗体、PE 标记的小鼠CD8 抗体，4℃避光孵育1 h，加入PBS 1 ml，1200 r/min（r=8 cm）离心5 min，重复1 次，用PBS 300 μl 重悬，采用流式细胞仪检测细胞百分率。（7）血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平：采用ELISA 法检测小鼠血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平。具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况正常组小鼠被毛光亮，活动灵活，大便棕黑色，干湿适度。模型组小鼠腹腔注射环磷酰胺后第3 天出现活动减少，食量下降，扎堆明显，喜抱团，易惊，毛色黯淡，阴囊皱缩，炸毛、掉毛现象。给药一周后，A、B、C、D、E 组小鼠食量均逐渐增加，活动增多，扎堆减少，停止掉毛，毛色恢复柔顺光亮。但A、C 组效果更明显。

2.2 各组脾脏指数和胰腺指数比较 A、B、C、D、E各组给药2 周后体质量、脾脏指数和胰腺指数均显著高于模型组（P＜0.05），C 组给药2 周后脾脏指数和胰腺指数及体质量与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05），其余各组体质量、脾脏指数和胰腺指数均显著低于正常组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组脾脏指数和胰腺指数比较（±s）