五味苦参肠溶胶囊对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠关于miR-124/STAT3通路表达影响的研究

张瑞洲 鲍秀琦 韩宇鹏 姜威 陈刚 甘旭颖

【摘要】目的 探究五味苦参肠溶胶囊（Five-Flavor Sophora flavescens Enteric-Coated Capsules FSEC）对葡聚糖硫酸钠（Dextran sodium sulfate DSS）诱导的溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis UC）模型小鼠结肠组织中miR-124/STAT3通路表达的影响。方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为空白组、模型组、FSEC组，每组10只。模型组、FSEC组饮用3%DSS水7d，空白组正常饮水7d。造模完成后，FSEC组给予3.84/kg/天浓度的五味苦参肠溶胶囊溶液灌肠7d，空白组及模型组则给与等量的生理盐水灌肠7d。随后，将全部小鼠切换到正常饮食，观察各组小鼠的一般状态，计算DAI评分。一周后处死小鼠，取结肠组织。提取RNA，实时定量PCR检测miR-124/STAT3通路的表达水平。结果：miR-124中模型组及FSEC组均与空白组有显著的统计学差异（P<0.01），FSEC组与模型组具有显著的统计学差异（P<0.01）。STAT3中模型组及FSEC组均与空白组有显著的统计学差异（P<0.01）、FSEC组与模型组具有统计学差异（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相对表达情况呈负相关。

【关键词】五味苦参肠溶胶囊;溃疡性结肠炎;miR-124/STAT3通路

【中图分类号】R97   【文献标识码】A   【文章编号】2026-5328（2021）12--02

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性免疫介导的大肠炎症，常与直肠炎症有关，但通常向近端延伸，累及结肠的其他区域[1]。主要症状为持续或反复发作的腹泻、黏液膿血便伴腹痛、里急 后重和不同程度的全身症状[2]长期溃疡性结肠炎也与明确的不典型增生和结直肠癌的风险有关[1]。传统的UC口服药物包括但不仅限于5-氨基水杨酸药物（5-ASA），糖皮质激素，英夫利昔单抗等。但是传统口服药物存在疗效欠佳，不良反应明显等问题。故在UC的临床治疗中，需要寻找一种疗效好，不良反应轻的口服药物。五位苦参肠溶胶囊（FSEC）是仝战旗【3-5】主任研制的国家新药，现有的研究表明，传统的中医方法【6】治疗UC的效果不亚于UC的常规临床治疗，且不良反应相较糖皮质激素等药物小。本实验通过检验FSEC对DSS诱导UC小鼠模型中miR-124/STAT3通路的影响，验证FSEC的疗效，为FSEC应用到临床治疗UC提供科学依据。

1材料及方法

1.1药物、试剂与仪器：葡聚糖硫酸钠（DSS）（美国MP公司），Hotstart HiTaq两步法逆转录试剂、miRNA 第一链 cDNA 合成、miRNA荧光定量PCR试剂盒、TRIzol（生工生物上海），Gel-Green染料（碧云天），DNAmaker（庄盟），6*loading Buffer（takara）荧光定量PCR管（赛默飞）光学显微镜（日本奥林巴斯），PCR仪（美国应用生物）。

1.2实验动物：健康成年雄性C57BL/6小鼠（30只，体重25-27克）购自辽宁长生生物技术股份有限公司

1.3实验方法：取健康雄性C57BL/6小鼠30只，随机分为空白组、模型组、FSEC组，每组10只。各组小鼠实验前适应性喂养1周后，模型组、FSEC组饮用浓度为3%DSS饮用水7d，空白组正常饮水7d。造模完成后，FSEC组给予3.84/kg/天浓度的五味苦参肠溶胶囊溶液灌肠7d，空白组及模型组则给与等量的生理盐水灌肠7d。

1.4小鼠疾病活动指数（DAI评分）：通多对小鼠有无黏液样便、肉眼血便、重量减轻、活动度减少、毛色变差等情况进行疾病活动指数（disease activity index DAI）评分，评分标准见表1【7】，

1.5实时荧光定量PCR检测（RT-PCR）：

①（1）取各组小鼠的结肠组织50mg，将取好的组织在液氮中用加入了1ml TRIzol的匀浆器中匀浆等RNA提取步骤获得总RNA ，

（2）使用miRNA 第一链 cDNA 合成试剂盒进行合成cDNA

（3）根据试剂说明进行荧光定量的反应体系配置

（4）设定反应程序

引物序列：miR-124上游 5′- GGACTTTCTTCA TTCACACCG-3′。

miR-124下游5′- GACCACTGAGGTTAGAGCCA-3′。

用2-ΔΔCt法计算相对表达量

②取各组小鼠的结肠组织50mg，将取好的组织在液氮中用加入了1ml TRIzol的匀浆器中匀浆，后续通过Hotstart HiTaq两步法逆转录试剂盒获得最终cDNA，并根据试剂说明进行PCR扩增体系配比。引物序列如下：

STAT3  上游 5′-GAAGGACA TCAGCGGTAAGA-3′。

STAT3  下游5′-AGA TAGACCAGTGGAGACAC-3′。

反应条件95℃，10min 用2-ΔΔCt法计算相对表达量

1.6统计学方法

采用SPSS25.0和Graphpad Prism8据分析软件进行分析，采用独立样本t检验方法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组小鼠的一般情况变化及临床表现

空白组：小鼠一般情况良好，体重随时间逐渐增加，无明显稀便、黏液样便、肉眼血便等，活动自如，毛色亮泽。

模型组：小鼠一般情况差，饮食减少，可见黏液便及肉眼血便，体重明显减轻，活动度差，精神不佳，毛色变差，无光泽。

FSEC组：模型小鼠给予FSEC灌肠治疗后，较于模型组有显著改善，体重减轻受到控制，活动度有所恢复，虽可见稀便及偶有黏液便，但无肉眼血便。

2.2各组小鼠结肠组织中miR-124及STAT3的相对表达量

根据miR-124的相对表达量可见，模型组及FSEC组均与空白组有显著的统计学差异（P<0.01），FSEC组与模型组具有显著的统计学差异（P<0.01）。STAT3的相对表达量，模型组及FSEC组均与空白组有显著的统计学差异（P<0.01）、FSEC组与模型组具有统计学差异（P<0.05）。而且miR-124及STAT3的相对表达情况呈负相关。

空白组（n=3） 模型组（n=3） FSEC组（n=3）

miR-124 1.00±0.08 0.68±0.15 0.81±0.16

STAT3 1.00±0.11 5.22±1.25 3.83±0.95

* P<0.05，**P<0.01

3讨论

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠道疾病（IBD）。这些疾病在严重程度、频率以及肠粘膜、先天和获得性免疫系统以及微生物群之间的相互作用都很复杂，到目前为止还没有确定疾病的病因。虽然治疗UC的药物有很多，包括氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂，这些药物通常对大多数患者有效，但不是所有患者都有效。而且，由于疗程较长，它们的使用通常受到不良反应的限制，停用它们往往会导致疾病复发，就需要新的、更有效的疗法。

MicroRNA是一种小的非编码RNA寡核苷酸，它在转录后调节蛋白表达，诱导信使RNA（Mrna）降解和/或抑制与30个非翻译区结合的靶基因的翻译，可以调节大量基因的表达，并参与不同的人类疾病。其中MIR-124可以抑制细胞增殖和转移，诱导细胞凋亡和氧化应激，许多炎症性疾病及肿瘤疾病的研究中都能看到miR-124/STAT3通路的影子：比如在食道癌中MiR-124过表达显著下调STAT3的mRNA和蛋白水平抑制疾病发展、STAT3信号通路参与了miR-124介导的对子宫内膜癌细胞的抑瘤作用。而对于UC而言，以往的研究表明IL6-STAT3信号通路在UC中的重要性，STAT3 缺乏显着降低了干扰素 （IFN）-γ、IL-6 和 IL-17A 的产生，而 IL-10 分泌增加，表明 STAT3 可能成为溃疡性结肠炎的治疗靶点，以往的实验验证了miR-124对STAT3磷酸化的抑制作用最大，可以直接调节人类结肠细胞中STAT3的表达且UC活动期儿童患者miR-124表达下调导致STAT3表达上调，其相关下游靶基因VEGF、BCL2、BCLXL和MMP9表达上调。UC活动期患儿组织中miR-124的抑制归因于STAT3启动子区域的高甲基化。因此，靶向miR-124和STAT3可能为UC的治疗提供了一种新的途径。

本实验结果显示与模型组相比FSEC治疗组可使miR-124表达水平上升，STAT3表达水平下降，证明FSEC可以通过影响miR-124/STAT3通路来达到治疗效果，证明FSEC对UC有一定治疗效果。

参考文献：

【1】Rubin， D.T.， Ananthakrishnan， A.N.， Siegel， C.A.， Sauer， B.G.， & Long， M.D. （2019）. ACG Clinical Guideline： Ulcerative Colitis in Adults. The American Journal of Gastroenterology， 114， 384-413.

【2】吳开春，梁洁，冉志华，钱家鸣，杨红，陈旻湖，何瑶.炎症性肠病诊断与治疗的共识意见（2018年·北京）[J].中国实用内科杂志，2018，38（09）：796-813.

【3】罗丹，高路，仝战旗，张晨.五味苦参肠溶胶囊对溃疡性结肠炎小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶1、白细胞介素-1β蛋白的影响[J].解放军医学院学报，2018，39（02）：140-143+149.

【4】罗丹，高路，仝战旗，王世达，张亮，张晨.五味苦参肠溶胶囊对溃疡性结肠炎小鼠炎性因子的影响[J].中华中医药杂志，2018，33（10）：4719-4722.

【5】罗丹. 基于NLRP3/IL-1β/IL-17信号通路探讨五味苦参肠溶胶囊治疗溃疡性结肠炎的实验研究[D].中国人民解放军医学院，2018.

【6】李军祥，陈誩.溃疡性结肠炎中西医结合诊疗共识意见（2017年）[J].中国中西医结合消化杂志，2018，26（02）：105-111+120.

【7】朱成雷，穆晶晶，徐静雯，王琳琳，周郑坤，郑元林，陈才法.紫甘薯花青素对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障损伤的修复作用[J].中国病理生理杂志，2020，36（10）：1844-1853.

通讯作者：鲍秀琦（1963-），女，主任医师，硕士，硕士生导师，

第一作者：张瑞洲（1995-），男，硕士生在读

基金项目：黑龙江省卫生计生委科研课题（2019-KYYWF-1346）