姜黄素对UUO大鼠肾组织中ASK1、JNK/AP-1信号通路及Periostin蛋白表达的影响

杨丽微 康晓明 杨松

【摘要】目的：研究姜黄素对凋亡信号调节激酶1（apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1）及c-jun氨基酸末端激酶（c-junN-terminalkinase ，JNK）/转录因子激活蛋白-1（activatedprotein-1，AP-1）信号通路以及骨膜蛋白（Periostin）在单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠间质纤维化肾脏组织中的作用及影响。方法：将正常雄性 Wistar大鼠72只，分为假手术组，UU0组，姜黄素治疗组。各组大鼠建立单侧输尿管梗阻模型，治疗组（姜黄素2OOmg/ kg.d用0.9%生理盐水溶解后2毫升灌胃）、假手术组、UU0组（仅采用等量生理盐水灌胃）于术后3d、7d和14d，分别处死三组实验大鼠。结果：与相应时间点空白组对比，随UUO大鼠梗阻时间延长，肾小管间质损伤和纤维化程度加重，ASK1、JNK1、Periostin蛋白表达逐渐增加差异具有统计学意义 （ P<0.05），相较模型组治疗组大鼠肾间质组织中 ASK1、JNK1、Periostin蛋白表达显著降低差异具有统计学意义 （ P<0.05）结论：姜黄素可能通过抑制肾组织中ASK1进而影响JNK/AP-1通路的表达，影响其下游Periostin蛋白的表达量，从而改善肾间质纤维化程度。

【关键词】肾脏纤维化 姜黄素 ASK1 JNK/AP-1通路 Periostin蛋白

【中图分类号】R97   【文献标识码】A   【文章编号】2026-5328（2021）12--02

肾小管间质纤维化是各种病因导致肾脏实质及间质细胞损伤后引发的最终组织学转归过程[1]。肾纤维化的主要病理包括炎性细胞浸润、成纤维细胞活化和增殖，以及主要由胶原、纤连蛋白和蛋白聚糖组成的细胞外基质成分的异常增加和过度沉积[2]。此外，越来越多的证据表明细胞外基质的衍生成分可用作危险相关分子模式作为纤维化的重要促进者，只要炎症刺激因素持续存在，这些损伤会在细胞活化和损伤阶段产生并持续释放信号，最终促进炎症向纤维化肾脏疾病发展[3]。近年来逐渐发现姜黄素具有抗脏器纤维化的潜能，可通过不同途径发挥抗肺纤维化、肝纤维化、心纤维化及肾纤维化作用，具体抗纤维化机制尚不明确[4]。姜黄素能够抗氧化和清除自由基，抑肾间质纤维化，可调节UUO大鼠肾功能指标水平，改善肾组织的病理变化，进而改善肾间质纤维化和肾功能[5]。姜黄素对大鼠的保护作用与其抑制氧化应激、增强机体抗氧化能力、提高抗炎因子表达、抑制促炎因子表达有关，从而起到抑制肾间质ECM增生、基底膜增厚、肾小球硬化和肾小管间质纤维化，延缓肾功能衰竭。

1.材料與方法

1.1实验动物及试剂

SPF ，雄性，Wistar大鼠，72只，体重约140±10g。

姜黄素，兔抗大鼠ASK1，JNK1，Periostin蛋白多克隆抗体，DAB 显色试剂盒、免疫组化试剂盒，动物组织总RNA提取试剂盒，反转录试剂盒，实时荧光定量PCR试剂盒。

1.2方法

1.2.1实验步骤

将正常雄性 Wistar大鼠72只，体重在15Og±1Og，分为假手术组， UU0组，姜黄素治疗组。各组的大鼠建立单侧输尿管梗阻模型，应用水合氯醛 0.1g/kg，配置成1：10浓度进行灌胃，待角膜反射消失，于背部行纵切口，逐层剥离左侧输尿管，远离肾盂1cm结扎输尿管。假手术组只是通过游离大鼠的输尿管，不结扎。治疗组（姜黄素2OOmg/ kg.d用0.9%生理盐水溶解后2毫升灌胃）、假手术组、UU0组（仅采用等量生理盐水灌胃） ，手在术后3d、7d和14d结束时，分别处死三组实验大鼠，取左侧肾脏。通过苏木精 — 伊红染色法 和实时荧光定量-PCR检测观察各组实验大鼠肾脏中的病理变化及ASK1、JNK1、Periostin蛋白和mRNA的表达变化情况。

1.2.2HE染色

各组肾组织依次脱水、透明、浸蜡及包埋，制成3μm 切片，分别行 HE 染色，观察肾小管间质损伤和纤维化状况。对损伤程度进行评分（TIS）。

1.2.3PCR步骤

将冷存肾组织进行均匀研磨，移入DNA-Cleaning Column管中，分次离心纯化完成总RNA的提取。而后在冰上进行操作将RNA反转录成cDNA第一链，将反转录出的cDNA用于实时荧光定量PCR检测。根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析，计算出结果。

1.3.统计学方法

使用SP SSs25..0统计软件对本实验研究数据进行分析，各组别数据皆以均数±标准差（）的形式表示，组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1HE结果分析

镜下观察，假手术组大鼠不同时间点肾脏整体成分，结构无明显异常，UUO组大鼠术后第3天HE染色结构显示肾小管官腔轻度扩张，上皮细胞出现轻度水肿，出现少量炎症细胞浸润。第7天，管腔结构扩张明显，且数量增多，可见少许脱落的上皮细胞及蛋白管型，炎症细胞渗出进一步增多;术后14天可见肾脏皮髓质层明显萎缩变小，管腔严重变形，管腔表皮细胞出现坏死、脱落较重，大量炎细胞浸润。与UUO组对应时间点相比，治疗组损伤程度减轻，差异有统计学意义（P<0.05）。见图一

2.2pcr

2.3.1三组实验大鼠ASK1 mRNA的表达

PCR结果显示：假手术组大鼠肾组织中ASK1 mRNA的表达量较少，相较于假手术组UUO组大鼠各时间点肾组织中ASK1 mRNA表达量随梗阻时间延长逐渐增高;与UUO组相对应的时间点ASK1 mRNA的表达对比，治疗组的表达均下降，差别有统计学意义（P <0.05）。见表一

2.3.2 大鼠肾脏组织JNK1-mRNA表达的检测

PCR结果显示：假手术组中JNK1-mRNA少量表达，相较于假手术组UUO组各时间点JNK1-mRNA表达呈现升高趋势，与UUO组同时间点JNK1-mRNA表达量对比，治疗组表达均降低，差别有统计学意义（bP<0.05）。见表一

2.3.3大鼠肾脏组织periostin mRNA表达的检测

PCR结果显示：假手术组中periostin mRNA少量表达，同比假手术组UUO组各时间点periostin mRNA表达呈上升走势，与UUO组同时间点periostin mRNA表达量对比，治疗组表达均降低，差别有统计学意义（bP<0.05）。见表一

3.讨 论

ASK1在各种纤维化疾病中发挥重要调节作用。肾组织活检发现在各类纤维化肾脏疾病患者中，ASK1下游信号通路JNK活化水平在肾小球和肾小管间质中增加。有研究表明，肾损伤的修复与JNK引起的促纤维化信号有关，并且JNK可以抑制单侧输尿管梗阻的腎小管间质纤维化，其作用的发挥可能与其下游periostin蛋白的抑制有关， 当代中国中医药经典著作《中华本草》《中华人民共和国药典》中都提到了姜黄素具有止痛、清心、活血、行气、驱寒、消炎等药用价值。近年来逐渐发现姜黄素具有抗脏器纤维化的潜能，姜黄素能够抑制肾小管上皮细胞增殖，阻止肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化，并能减少EMC质成分的合成，具有干预肾间质纤维化的作用。结合本实验研结果发现，ASK1、JNK1、periostin随梗阻时间延长表达量逐渐增加， 论证periostin是重要的致纤维化因子，并且其致纤维化作用是通过ASK1调节JNK/AP-1通路实现的。本实验通过姜黄素干预后更进一步证明姜黄素可影响ASK1表达，从而调节JNK/AP-1通路，干预其下游periostin对纤维化过程中间质沉积及间质转分化的作用，从而延缓肾纤维化的进程，发挥保护肾脏的作用，本实验发现姜黄素是治疗肾脏纤维化极具潜力的药物，但具体的作用机制有待于进一步深入研究。

参考文献：

[1]Cybulsky A. V. Endoplasmic reticulum stress， the unfolded protein response and autophagy in kidney diseases. Nature Reviews Nephrology. 2017;13（11）：681-696.

[2]Taniguchi M.， Yoshida H. Endoplasmic reticulum stress in kidney function and disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 2017;24（4）：345-350.

[3]Dikalov S. Cross talk between mitochondria and NADPH oxidases. Free Radical Biology & Medicine. 2019;51（7）：1289-1301.

[4]宋玮. 姜黄素对糖尿病肾病大鼠肾脏的保护作用及机制研究 [J]. 郑州： 郑州大学，2014.

[5]Liang C，LiX，ZhangL，etal.T heanti fibr oticeffe ctsofmicroRNA -153 by targeting TGFBR-2 inpulmonary fibrosis[J].ExpMolPathol，2015，99（2）：279-285