梅毒血清固定患者外周血CD14+单核细胞Toll样受体及其炎性因子的检测

徐超，陶勇峰，马启超，王红霞，林丽萍，毕海青

（宁波市鄞州区第二医院，浙江 宁波 315100）

迄今为止，梅毒血清固定形成的免疫分子学机制仍然不是十分清楚，大部分研究认为，梅毒螺旋体（Treponema pallidum，TP）进入人体后，首先激活机体天然免疫防御系统，即自然杀伤细胞（NK）清除TP，随后T淋巴细胞介导的特异性免疫共同参与[1-2]，因而作为天然免疫识别受体的Toll样受体（TLRs）自然也就成为了关键点所在，目前已经证实，TLRs体不仅对各种病原微生物抗原能够识别，还可以通过信号刺激传导途径来活化免疫应答细胞，启动和激活获得性细胞免疫[3]，TP脂蛋白激活单核细胞时除了需要TLRs的结合，也需要其膜上与之密切相关的CD14分子的协助作用[4]。因此笔者拟以此作为研究的深入点，分析梅毒血清固定患者外周血单核细胞中CD14+TLR2、CD14+TLR4及其炎性因子的表达，并探讨其在形成血清固定现象中可能发挥的作用。

1 对象与方法

1.1 对象 梅毒患者来源于本院皮肤科性病诊疗中心，收集患者治疗前后的血清样本，分别统计血清固定、血清转阴各35例和梅毒患者30例。对照组30例来自健康体检中心，血清固定判定标准为：确诊梅毒，血清甲苯胺红不需加热血清试验（TRUST）稀释、梅毒螺旋体颗粒凝胶试验（TPPA）检测同时阳性，并依据《性传播疾病临床治疗与防治指南》予以正规抗梅治疗，TRUST滴度下降到一定程度（≤1∶4），持续超过3个月不转阴者，即为血清固定，跟踪随访2年，需排除人类免疫缺陷病毒（HIV）感染、神经梅毒、再感染梅毒。

1.2 方法

1.2.1 试剂 同型对照 IgG-PE（554681Ms）抗体以及鼠抗人 FITC-CD14 （553739Ms）、PE-TLR4（551964Hu）、TLR2（558319Hu）单抗，购自 Becton Dickinso公司，RPMI 1 640培养液、淋巴细胞分离液、固定剂和破膜剂、LPS（HEL002）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α，HET019）和白细胞介素（IL）-6 酶联免疫吸附测定（ELISA，PIE032）试剂盒购自上海博谷，流式细胞仪来自Backman Coulter公司。

1.2.2 标本制备 抗凝静脉血3 mL摇匀，按照密度梯度离心法，在15 mL玻璃离心管中加入3 mL淋巴细胞分离液，小心吸取抗凝血沿管壁加至分离液液面上，水平离心机（755VES）2 000 转/min，20 min，自上而下出现4层，分别是血浆层、乳白色淋巴细胞层、透明分离液层、红细胞层，吸管小心吸出第二层单个外周血单核细胞（PBMC），转移至离心管中用RPMI1640按照6×106/mL浓度重新悬浮（细胞分离数量≥90%，存活率≥95%），PBMC中单核细胞的占比偏低，大约占10%～30%，因此需要在检测前，加入LPS（最适浓度10 μg/mL）对分离出来的单核细胞进行刺激培养，37℃、5% CO2保存，24 h（最佳时间）备用。

1.2.3 CD14+TLR2、CD14+TLR4细胞的检测 8个检测管中加入细胞悬液，相应的同型对照抗体加入其中6个检测管作为阴性对照，CD14-FITC抗体加入剩余2个检测管，室温孵育避光，按说明书依次固定和破膜后，分别加入PE标记的TLR2、TLR4单抗，充分混匀，在细胞内完成分子标记，离心清洗去上清后，磷酸盐缓冲液（PBS）重新悬浮，上流式细胞仪检测。

1.2.4 ELISA检测TNF-α和IL-6 按照双抗体夹心法操作说明，标准品需要倍比稀释后加样，置于酶标仪上各孔中，在波长450 nm处，空白对照孔归零后，依次测定各孔的吸光度（Optical density，OD）值，制作标准曲线，计算出IL-6和TNF-α的数值。

1.3 统计学分析 软件SPSS24.0分析和处理相关数据，测得结果计量资料用（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

4组患者中，固定组患者外周血中CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α、IL-6 表达的百分率最低，与其他3组比较差异有统计学意义（P＜0.05），梅毒组表达的百分率最高，与转阴组和对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而转阴组和对照组之间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。患者PBMC的流式细胞图见图1。

表1 4组患者 PBMC CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和 IL-6的表达情况 （%，±s）

表1 4组患者 PBMC CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和 IL-6的表达情况 （%，±s）

组别 n C D 1 4+T L R 2 C D 1 4+T L R 4 T N F-α I L-6固定组 3 5 5 6.1 4±5.1 3 2.9 4±1.3 2 3.0 4±1.1 6 1.2 4±0.4 5梅毒组 3 0 6 9.4 9±5.4 7 4.6 7±1.3 8 4.9 8±1.9 8 2.9 5±0.6 3转阴组 3 5 6 2.2 3±5.6 6 3.8 2±1.0 2 3.8 5±1.3 6 1.5 2±0.6 7对照组 3 0 6 1.9 6±5.7 2 3.5 9±1.6 9 3.9 6±1.4 8 1.6 0±0.6 5

图1 各检测组CD14+TLR2、CD14+TLR4流式图

3 讨论

CD14和TLRs是新近发现的主要在固有免疫细胞表面表达的模式识别受体，能够通过病原体相关分子模式（AMP）对多种病原生物表面的抗原成分进行免疫识别，在抵抗微生物入侵和引发宿主防御反应中发挥着至关重要的作用[5-6]。作为LPS高亲和力的受体，CD14分子由于缺乏胞内结构域，需要与TLR4结合形成受体复合物，才能将识别LPS的信号向细胞内传递[7]，而TP膜脂蛋白作为配体也能够被TLR2识别，并且需要CD14的协同，才能从胞膜外受体结合区域活化转导信号，传导至胞浆TIR（Toll/IL-1R homologous region）区域[8-9]，因此在天然免疫监视系统中，CD14和TLR2、TLR4是需要彼此相互间的密切组合，经过非MyD88（Myeloid differentiation factor 88）依赖型和MyD88依赖型2种不同信号传导途径，激活神经因子（NF）-κB[10-11]，并使 NF-κB 活化转移到胞核，诱导IL和TNF-α等相关炎性因子和趋化因子的表达、干扰诱导型NO合成酶的靶基因转录[12]，在引发天然免疫的同时，又能够促进DC的成熟，进而完成抗原提呈，使获得性免疫启动，有效地调节细胞增殖、转化和凋亡[13-14]。

本研究发现，所有受试者中，CD14+TLR2、CD14+TLR4、TNF-α和IL-6的表达比值在固定组患者中最低，在梅毒感染者中其比值最高，但与转阴组和对照组相比较，差异有统计学意义，导致的原因可能是随着梅毒病情发展和临床治疗的进行，使得比值慢慢出现了改变，TP全部被药物和机体免疫系统杀死的患者血清转阴，而少部分患者TP由血液淋巴循环进入局部隐匿部位[15]，造成膜脂蛋白刺激信号减弱或持续下降，导致患者体内TLR2、TLR4的低表达，通过MyD88、NF-κB途径转导，向下游诱导产生的TNF-α和IL-6等前炎性因子大量减少[16]，引起级联免疫反应减弱，Th1活化受到阻碍，Th1/Th2比例出现失衡现象，Th2表达相对比较活跃[17-18]，机体免疫应答反应不能进入有效状态，致使TP感染进入慢性阶段，最终导致了血清固定的发生。

综上所述，TLRs家族中的TLR2、TLR4可能是通过CD14分子的协助，调控机体免疫系统的应答，参与免疫效应细胞对TP的识别、信号传导和清除，并在其中起着相互影响的关键性作用。因此TLRs作为桥梁，联系了梅毒螺旋体引发的天然免疫和获得性免疫过程。但是不管在梅毒感染期还是固定期，机体内产生的TLRs传导的信号在激活单核细胞完成免疫反应后也能及时促使其凋亡，这种适当控制炎性反应强度来维持免疫平衡的调节作用对于影响梅毒血清固定的发生、发展的具体机制尚需进一步研究。