谷子穗发育期转录组与叶酸代谢谱联合分析

马贵芳 满夏夏 张益娟 高 豪 孙朝霞,3 李红英,3 韩渊怀,3侯思宇,3,*

1 山西农业大学农学院 / 农业生物工程研究所, 山西太谷 030801; 2 山西农业大学生命科学学院, 山西太谷 030801; 3 杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室, 山西太原 030031

叶酸是由蝶呤、对氨基苯甲酸和多聚谷氨酸组成的一种水溶性B族维生素, 又称维生素B9或维生素 M[1], 作为细胞中主要的一碳单位供体和受体参与生物体内一碳代谢[2]。四氢叶酸(tetrahydrofolate,THF)是一碳单位的主要载体, 在其转运过程中起辅酶作用, 如嘌呤和胸腺嘧啶的合成[3]。在生物界中,植物、真菌和大多数细菌能够从头合成叶酸, 但高等动物包括人类却无法合成, 完全依赖日常饮食摄入来完成体内生理生化过程。叶酸在人体内主要以5-甲基四氢叶酸(5-methyltetrahydrofolate, 5-M-THF)参与代谢过程时转化为THF形式发挥作用[4]。在植物中, 叶酸生物合成有明显细胞区域化特征, 分别于叶绿体、细胞质和线粒体中合成[5]。其中, 蝶呤和对氨基苯甲酸(p-Aminobenzoate, pABA)在胞质和叶绿体中合成; 随后, THF分子在线粒体中组装, 并添加谷氨酸尾巴。蝶呤部分的合成始于由鸟苷三磷酸环化水解酶(GTP cyclohydrolase I, GCHI)催化GTP生成二氢新蝶呤三磷酸(dihydroneopterin triphosphate, DHN-P3), DHN-P3经磷酸水解生成二氢新蝶呤(dihydroneopterin, DHN), DHN在二氢新蝶呤醛缩酶(dihydroneopterin aldolase, DHNA)作用下生成羟甲基二氢蝶呤(dihydroneopterin to 6-hydroxymethyldihydropterin, HMDHP)。

植物体合成pABA分为2步, 第1步是由氨基脱氧分支酸合成酶(ainodeoxychorismate synthase,ADCS)作用生成氨基脱氧分支酸(ainodeoxychorismate, ADC), 第 2步由氨基脱氧分支酸裂解酶(ainodeoxychorismate lyase, ADCL)催化ADC生成pABA。最后, 在线粒体中合成叶酸(图1,参考单齐冀[6], 略作修改)。HMDHP在羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶(hydroxymethyldihydropterin pyrophospho kinase, HPPK)催化下生成 HMDHP-P2,HMDHP-P2与 pABA 偶联, 生成二氢蝶呤(dihydropteroate, DHP)。这个反应是由二氢蝶呤合成酶(dihydropteroate synthase, DHPS)介导的, DHPS催化DHP和谷氨酸生成二氢叶酸(dihydrofolate, DHF),经二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase, DHFR)催化DHF生成THF; 最后经多谷氨酰四氢叶酸合成酶(folylpolyglutamate synthase, FPGS)催化THF加多聚谷氨酸尾巴生成多谷氨酰四氢叶酸(polyglutamic acid tetrahydrofolic acid, THF-Glun), 这种叶酸分子主要参与一碳代谢的叶酸依赖型酶促反应[5]。鸟苷三磷酸环化水解酶(gamma-glutamyl hydrolase, GGH)的活性可去除多谷氨酸尾巴, 在调节叶酸稳态中起重要作用[7]。

谷子[Setaria italica(L.) P.Beauv.]距今已有八千年的栽培历史[8], 是一种营养价值极高的杂粮作物[9]; 其籽粒脱壳后为小米, 富含蛋白质、脂肪、糖类、维生素, 以及钙、磷、铁等人体所必需的微量元素。粮食类作物的叶酸含量在 0.39～2.63 μg g-1DW之间, 其中小米中总叶酸含量为1.53 μg g-1DW,远高于燕麦、苦荞、薏米和水稻, 但与人体每日摄取推荐量日常推荐摄入标准(400～500 μg)相比, 差距较大[10]。目前谷子叶酸的研究尚停滞在叶酸提取及含量测定方法优化和种质资源评价等方面, 如邵丽华等[11]利用磷酸二氢钾溶液恒温水浴浸提叶酸,并通过高锰酸钾氧化-间接荧光法测定245份谷子资源的叶酸含量发现, ‘晋谷21’为高叶酸含量品种。侯思宇等[12]利用改良三酶法结合高效液相色谱法(HPLC)测定2年同一环境下种植的45份谷子资源叶酸含量发现, ‘晋谷 21’总叶酸含量为(2.00±0.02) μg g-1DW, 在所有测试品种最高。为达到生物强化的目的,在水稻[13]、玉米[14]、小麦[15]等作物中已做了一些叶酸代谢特征及相关基因表达模式的研究。Storozhenko等[16]报道, 通过强化pABA和蝶呤支路获得了比对照品种叶酸含量提升 100倍的水稻种子。汪冉冉[17]利用基因枪法将GCHI与ADCS基因转入小麦幼胚愈伤组织中, 收获的 T1代小麦籽粒中叶酸含量显著提升。尽管前人对谷子叶酸提取及含量测定等进行了相关研究, 但针对其代谢物种类及代谢分子机制方面的研究尚属空白。因此, 本研究拟通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS), 初步揭示谷子穗发育过程中叶酸代谢物积累的动态规律; 结合转录组分析挖掘叶酸代谢物与相关基因表达模式的相关性, 找到潜在的叶酸强化靶基因, 以期为谷子叶酸生物强化奠定理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

‘晋谷21’于2019年4月中旬种植于山西农业大学杂粮基地(东经 112°28′, 北纬 37°12′)。分别对灌浆中前期(S1, 抽穗后 25 d)、灌浆中后期(S2, 抽穗后39 d)和收获期(S3, 抽穗后53 d)的穗中部进行取材。每个时期收集 10个单穗相同部位的小穗混合为测试材料, -80℃保存备用。

1.2 叶酸代谢物提取与LC-MS法测定

参考Wan等[18]方法提取叶酸。5 g样品粉末沸水浴 10 min, 迅速转移至冰上; 加入 15 μL α-淀粉酶(30 min, 37℃)和 20 μL 蛋白酶(60 min, 37℃)后离心(4℃, 10,000×g, 20 min), 取上清液20 μL过滤后进行液相色谱-串联质谱法(high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLCMS/MS)分析。使用 Agilent 1260 HPLC系统和Agilent分析柱(Poroshell 120 SB-C18, 2.1 mm×75.0 mm, 2.7 μm)进行色谱分析, 在 4℃下进样 15 μL, 柱温箱温度保持在 25℃。流动相为 0.1% (v/v)水甲酸和0.1% (v/v)乙腈甲酸, 流速0.3 mL min-1, 梯度程序为20 min。使用Agilent 6420三重串联四极杆液质联用系统与电子喷雾电离界面进行叶酸的分析和定量。质谱仪(MS)在阳离子模式下运行, 使用Agilent Mass Hunter软件采集并分析数据, 12种叶酸化合物作为内标进行定量分析(测定参数见附表1)。

1.3 转录组数据分析

如1.2所述材料, 每个时期设置3个生物学重复,提取总RNA。RNA-seq由派森诺生物科技有限公司(上海)完成, 在Illumina Hi Seq 2500平台上构建了9个文库并对这些文库进行双末端(Paired-end, PE)测序, 原始数据经过质控后过滤掉低质量测序Reads,使用HISAT2 (http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml)软件将过滤后的 Reads比对到参考基因组(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Sitalica)上。使用HTSeq计算基因表达量,用FPKM值表示。DESeq软件分析基因表达差异, 设置参数为: 表达差异倍数|log2Fold Change|＞1, 显著性P-value＜0.05。对差异表达基因(difference expression genes, DEGs)进行 KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。

1.4 基因可变剪切、共相关分析及差异基因蛋白网络互作分析

采用 String Tie (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml)对 Hisat2比对结果拼接, 通过ASprofile (http://ccb.jhu.edu/software/ASprofile/)软件获取每个样品可变剪接类型。用SPSS 20.0软件进行双变量分析, Pearson相关系数进行相关性分析。利用 STRING 网站(http://string-db.org/)构建谷子不同代谢路径基因间蛋白互作网络。

2 结果与分析

2.1 谷子穗发育期穗部叶酸组分特征

由图2可知, 12种叶酸标准物中可检测到9种化合物, 分别是 5-M-THF、5-M-THFGlu3、5-M-THFGlu4、5,10-CH=THF、10-F-FA、5-F-THF、5-F-THFGlu2、5-F-THFGlu4和 FA。整个穗发育期, 对叶酸含量贡献最大的为 5-M-THF和 10-F-FA, 尤其在S1, 二者含量分别达到1.27 μg g-1FW和1.64 μg g-1FW, 显著高于其他时期的其他叶酸组分。其次为5-F-THFGlu2, 在S1～S3期含量分别为1.22、0.78和0.56 μg g-1FW。而 5-M-THFGlu3和 5-M-THFGlu4只在S2和S3期被检测到, 5,10-CH=THF只在S2期被检测到。相比其他叶酸组分, 5-F-THFGlu4整体含量最低,尤其在S1期含量仅为0.0014 μg g-1FW。而在S1～S3期, 并未检测到 THF、5-M-THFGlu2和 5-F-THFGlu3的积累。同时, 本研究发现总叶酸含量随谷穗发育时期呈下降趋势, S1～S3含量分别为3.77、3.21和1.89 μg g-1FW, 与10-F-FA和5-M-THF含量随穗发育期下降趋势相一致。其他组分如 FA含量在穗发育不同阶段整体差异不显著。表明10-F-FA和5-M-THF含量是影响谷穗不同发育阶段叶酸总含量的主要组分。

2.2 转录组数据组装与样品相关性分析

RNA-seq结果显示, 相同生物重复的样本间相关性较好, 相关性范围在 0.982～1.000; 不同时期小穗样品间相关性在0.011～0.803之间, 表明不同样品之间有明显差异(附图1)。对 9个 RNA-Seq文库测序过滤后分析得Clean Reads在93.47%～94.91%定位到参考基因组上且各样品Q30碱基百分比平均不小于 93.27% (附表2), 证明我们样本选择的合理性和试验结果的可靠性。

2.3 谷穗发育时期差异表达基因分析

基于 RNA-seq两两组合比较分析, 共鉴定出4700个DEGs。其中S1 vs.S2鉴定出2263个DEGs,包含1213个表达上调和1050个表达下调基因; S1 vs.S3鉴定出3480个DEGs, 上调和下调表达的基因数为1370个和2110个; S2 vs.S3中鉴定出1577个DEGs,包含737个和840个表达上调和下调基因(图3-a)。

S1 vs.S2和 S1 vs.S3、S1 vs.S2和S2 vs.S3、S1 vs.S3和S2 vs.S3的两两组合之间交集分析发现,分别存在 1381、372、1045个 DEGs, 其中 688个DEGs特异的存在于S1 vs.S2, 1232个DEGs特异的存在于S1 vs.S3, 338个DEGs特异存在于S2 vs.S3,三者共有的DEGs为178个(图3-b)。

对上述DEGs进行功能注释, 共有7121个可注释到 NR数据库, 占比 99.3%; 接下来依次为eggNOG、Swiss-ProtGO和KEGG (附图2)。KEGG注释分析表明, 两两比较得到的 DEGs可注释到生物体系统、新陈代谢、遗传信息处理、环境信息处理和细胞过程, 共计五大类(附图3-a～c)。其中涉及新陈代谢类的基因数量最多, 在 S1 vs.S2、S1 vs.S3、S2 vs.S3中分别占总注释基因数量的81.8%、81.9%和79.2%。同时发现, 苯丙烷类物质的生物合成、淀粉和蔗糖代谢和植物激素信号传导这 3个代谢通路中差异表达基因数目较多, 其中S1 vs.S2分别达到42、31和23个; S1 vs.S3分别为75、43和31个; S2 vs.S3分别有21、22和13个。

2.4 谷子穗发育时期基因的可变剪切类型及数目变化

在 S1～S3期共检测到 19,017个基因, 包含54,297处可变剪切, 根据剪切方式不同划分为 5种类型, 分别为外显子跳跃型(exon skipping, ES)、内含子滞留型(intron retention, IR)、转录起始区域可变剪切(transcription start site, TSS)、转录终止区域可变剪切(transcription terminal site, TTS)和可变 5′或 3′端剪切(alternative exon ends, AE)。其中, TTS和TSS为主要可变剪切类型, 占比均为37.2%; 其次为IR、AE和ES, 分别占15.8%、5.0%和4.8%。可变剪切数目在穗发育时期呈动态变化, 如S1、S2、S3 TTS类型可变剪切发生的数目分别为 20,744、19,969和20,066个(图4)。叶酸生物合成途径上有 16个关键基因发生可变剪切且类型具有明显差异, 如只有ADCL1、DHFR1、DHFR2基因发生ES剪切, AE剪切只出现在ADCS、DHFR2、FPGS1、FPGS2基因中, 而 IR 剪切仅在ADCS、DHFS、DHFR1、DHFR2、FPGS1中被预测到。同时各时期可变剪切数目呈动态变化, 如DHFS基因在S1、S2、S3可变剪切发生数目分别为3、2、4个(附表3)。

2.5 叶酸合成途径相关基因表达与叶酸代谢物共相关分析

通过对叶酸代谢相关17个基因在穗发育期的表达特征分析发现, 有11个和6个基因分别在S2和S3期表达水平较低, 根据其基因表达模式可将上述基因聚为 2类(Group 1和Group 2)(图5)。在Group 1中ADCL3和GGH在S2表达量最高, 可达37.52和37.32;ADCS、ADCL1、GGH、DHFR1、DHFR2表达随着穗发育整体呈下降的趋势, 如ADCS在 3个时期的表达量分别为11.85、5.61、6.33。Group 2中基因又可分为2个亚类(I和II), I类中包含FPGS1、FPGS2、DHFS、ADCL2、DHPS1、DHPS2、HPPK1、HPPK2和DHNA1共9个基因, 呈现出S1、S3期高表达的特点; 在II类中包含DHNA2和GCHI, 仅在S3期表达水平较高(附表4)。叶酸合成与叶酸类化合物的相关性分析表明, 5-M-THF的含量与DHNA2呈显著负相关(r= -0.999,P＜0.05), 与GCHI呈极显著负相关(r= -1.000,P＜0.01); 10-F-FA和5-F-THFGlu2的含量分别与GGH和DHFR2基因的表达呈显著正相关(r=0.999,P＜0.05); FA的含量与ADCS呈显著正相关(r=1.000,P＜0.05) (附表5)。其他叶酸化合物与叶酸代谢相关基因表达无显著相关性。

2.6 叶酸偶联相关途径的基因表达与叶酸代谢物共相关分析

对叶酸偶联的一碳代谢相关基因表达聚类发现,21个基因在 3个时期内据表达量可以聚为三大类,Cluster A1中包含10个基因, 在S1期表达量较高,如SHMT3(serine hydroxymethyltransferase 3, 丝氨酸羟甲基转移酶 3), 在 3个时期的表达量分别为205.75、48.45和38.44; Cluster A2内5个基因在S2期达到最高表达, 如CMT1(methyltransferase, 甲基转移酶)的表达量为3.03、12.54和10.17。Cluster A3内 6个基因在 S3期表达较高, 如SHMT1(serine hydroxymethyltransferase 1, 丝氨酸羟甲基转移酶1),穗发育期表达量分别为 69.80、69.14和 80.02 (图6-a)。相关性分析发现, Cluster A1中基因与主要叶酸化合物呈正相关关系, 如10-F-FA与MET3呈显著正相关(r=1.000,P＜0.05); Cluster A2中SHMTI与主要叶酸化合物 5-F-THFGlu2呈显著负相关(r= -0.998,P＜0.05)(附表6)。

激素传导途径关键基因表达聚为 3类, 其中Cluster B1中的 4个基因在 S2表达较高, 如ABF(ABRE binding factor, ABRE结合因子), 表达量分别为22.19、24.55和22.34; Cluster B2中16个基因在S3期高表达, 且整体表达呈逐渐升高趋势, 如ETR(ethylene receptor, 乙烯受体, 表达量为 0.01、6.91和15.92); Cluster B3中17个基因在S1高表达, 且在穗发育后期整体表达量降低, 如COI1(coronatine-insensitive protein 1, 冠氨酸不敏感蛋白1, 表达量为 110.88、49.70和 68.77)。相关性分析发现,Cluster B2中基因与主要叶酸化合物呈负相关关系,如BRI1(protein brassinosteroid insensitive 1, 油菜素内脂膜受体)与 5-F-THFGlu2呈显著负相关(r=-0.998,P＜0.05); Cluster B3中基因与主要叶酸化合物呈正相关关系, 如基因ARF(auxin response factor,生长素响应因子)与 FA呈显著正相关(r=0.999,P＜0.05)(图6-b 和附表7)。

2.7 差异表达基因蛋白网络互作分析

叶酸合成基因DHFR1、DHFR2与叶酸偶联一碳代谢相关甲基化基因DDM1、DDM2、MET1、MET3之间存在共表达和互作关系(图7-a); 相关性分析表明,DHFR2与MET3之间呈极显著正相关(附表8)。在叶酸合成相关基因与激素信号传导途径关键基因的蛋白网络分析中发现,DHFR1与DHFR2并没有直接关联到激素类蛋白, 而是通过免疫相关蛋白elf8、HSP90、SGT1来连通互作, 其中激素相关蛋白FLS2、MPK6、MAPK1/3、COI1、EDS1、RAR1 与免疫蛋白也存在互作(图7-b); 同时发现免疫相关基因SGT1与激素途径关键基因MPK6呈显著正相关(附表9)。

3 讨论

3.1 谷穗发育过程中叶酸合成途径关键基因表达影响叶酸代谢物组成特征

谷子籽粒富含叶酸, 可作为人们日常摄入天然叶酸的来源之一。深入探讨其籽粒中叶酸代谢谱分布特征及相关基因表达模式, 为挖掘叶酸代谢关键基因, 获得高稳定性叶酸材料, 培育高品质谷子品种提供思路。Lian等[19]在研究玉米籽粒发育过程叶酸含量发现, 随着生育期的推进, 叶酸含量呈下降趋势, 这与本研究中谷穗叶酸含量变化规律一致。成熟小穗鲜样中所测得的叶酸总含量为1.89 μg g-1FW, 与本实验室测定干样含量存在差异(2.02 μg g-1DW)[12], 这是含水量差异所致。此外, 本研究仅用12个叶酸标准代谢物进行分析, 无法检测到谷穗中所有叶酸衍生物种类及含量, 也是导致测定结果差异的原因。

结合叶酸合成基因探讨叶酸含量变化与基因表达之间的关系发现, 穗发育 3个时期, 叶酸合成起始基因GCHI的表达整体呈上升趋势, 而分支酸途径叶酸合成起始基因ADCS的表达量呈下降趋势,同时总叶酸和主要叶酸代谢物含量随穗发育成熟均呈下降趋势, 推测这可能是由于穗发育后期ADCS基因低表达降低了 pABA的合成量, 导致总叶酸含量下降。韩娟英等[20]研究结果也表明, 只有叶酸合成基因GCHI和ADCS同时高表达, 总叶酸含量才可提升。

本研究发现, 在S1期, 11个叶酸合成基因处于高表达水平, 预示着叶酸代谢物在穗发育初期大量合成。结合叶酸含量测定, S1期5-M-THF的含量占总5-M-THF含量的46%, S2期占41%, 而S3期仅占13%。一碳代谢甲基化相关基因的表达也是影响叶酸代谢物含量变化的重要因素, 即THF大量合成后被甲基化, 叶酸代谢物稳定存在, 即可保持高含量的叶酸, 反之则含量降低, 这也是成熟谷穗中叶酸含量降低的重要原因。Lian等[19]对玉米籽粒中叶酸含量的研究发现, 在未成熟籽粒中的5-M-THF的含量高于成熟玉米籽, 进一步推测5-M-THF在穗发育前期高含量可能是由于籽粒发育早期一碳循环更活跃造成; Blancquaert等[21]在水稻pABA含量上也观察到类似的情况。除此之外, 叶酸介导所有生物必需的一碳转移反应, 如 10-F-THF和 5,10-CH=THF衍生物的代谢参与嘌呤和胸苷酸的产生[22],SHMT1通过参与羟甲基转移为生物合成提供一碳单位, 并影响叶酸代谢;DHFR2作为一碳途径和叶酸合成途径的关键基因, 与叶酸主要化合物之间联系紧密。在拟南芥中, THF合成的倒数第2个步骤是由双功能二氢叶酸还原-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)催完成[23-24]。在这类双功能酶中, DHFR酶位于N端, 将经过TS形成的 DHF还原为 THF[25]。此外, 在本研究中发现,GGH基因在S3期表达量降低, 这可能是由于GGH在叶酸代谢通路中所在的位置决定的, 已有研究表明, 当GGH基因过表达时,DHFR基因表达量下降,这是由于GGH过表达催化叶酸由聚谷氨酰胺化水解为单谷氨酰胺化(叶酸在循环中存在的唯一形式),生成大量的 THF, 从而抑制了 DHFR酶的活性; 当GGH表达被抑制时, DHFR酶的活有所上升[26]。上述结果暗示,ADCS、DHFR2和GGH基因可作为通过遗传改良提升叶酸含量的关键靶基因, 为创制高叶酸含量新种质提供可能。

3.2 可变剪切事件可能影响叶酸代谢物含量变化

可变剪切是基因转录后调控的重要手段, 提高真核生物有遗传水平的多样性, 研究表明可其在植物的生长发育过程中发挥重要的调控作用[27]。本研究发现, 16个叶酸合成关键基因发生了不同类型的可变剪切, 且在穗发育不同时期可变剪切数目不同。研究表明, IR的发生可在转录本中插入提前终止密码子, 使基因表达下调[28]。本研究中,FPGS1的表达量远低于FPGS2, 比较发现,FPGS1在 S1～S3期均发生了IR剪切, 而FPGS2并未发生此类型剪切。另有研究证实AE与ES剪切类型更易改变蛋白质的结合性质、活性和稳定性, 产生功能变化的蛋白质[29-31]。在本研究中DHFR1在3个时期发生这2种类型剪切数目分别为0、1和2个, 相应时期基因表达量分别为36.48、28.58和13.51;DHFR2基因剪切数目分别为4、5和3个, 表达量为18.50、13.69和11.73,通过剪切数目与表达量的差异推测DHFR2的氨基酸顺序发生了改变, 从而使基因表达降低, 蛋白活性改变[32]。这些结果暗示这种高频率可变剪切的发生可能与穗发育不同时期的叶酸含量动态变化密切相关, 叶酸代谢相关基因的可变剪切事件可能直接影响叶酸化合物代谢, 但其具体影响机制尚需进一步验证。

3.3 谷穗叶酸代谢参与植物激素和免疫途径协同调控植物生长发育过程

叶酸代谢与一碳代谢途径密切相关, 并通过免疫途径来调节激素信号传导。已有研究发现, 叶酸代谢途径通过调节蛋氨酸合酶控制的 DNA甲基化来干扰植物免疫[33]。叶酸在甲基化反应中提供S-腺苷蛋氨酸, 是甲基化反应的关键因素[34]。本研究发现, 一碳代谢甲基化关键酶基因DDM1、DDM2、MET1、MET3与叶酸合成基因DHFR1、DHFR2之间有直接关系, 但叶酸代谢基因与甲基化相关基因之间具体调控关系尚不明确。Wang等[35]发现, 高水平的 THF诱导MET1介导的拟南芥开花调节基因(FWA)表现出转录活性, 从而导致花期延迟, 且呈剂量依赖性。本研究中晋谷21为春播晚熟品种, 整个生育期需要130 d左右, 而从S1到S3期需要50～60 d,相比其他谷子品种生育期较长, 我们推测这可能与穗部早期叶酸大量合成, 启动甲基化基因表达, 抑制相关开花基因的转录活性, 从而延迟了穗发育时期和生育期有关。

激素信号传导在植物的生命活动中有着重要作用。水稻中叶酸含量的升高可诱导抗病相关基因的表达, 如胞内免疫受体RPM1[21], 增强抗病的能力。本研究中 FLS2、MPK6、MAPK1/3、COI1、EDS1、RAR1等激素信号传导途径的蛋白与叶酸途径关键蛋白之间通过抗病蛋白相互作用。这暗示着免疫途径关键蛋白elf8、HSP90、SGT1可能是叶酸途径与激素途径偶联的关键蛋白。同时, Finni等[36]研究发现, 高叶酸可增强拟南芥对黑斑病菌的抗性, 但这种抗性的产生依赖于水杨酸的生物合成。肖熙欧等[37]研究表明, EDS1是调控水杨酸合成基因ICS1和水杨酸下游信号基因表达的重要因子, 在植物抗病过程中发挥着重要作用。本研究通过蛋白网络分析发现, EDS1通过免疫蛋白SGTI与叶酸合成基因蛋白DHFR1和DHFR2有互作关系, 这进一步证明叶酸对激素信号传导和抗病机制调控有一定的影响,但机制尚不明确。

4 结论

首次解析‘晋谷 21’穗发育期叶酸组分特征, 鉴定出 9种叶酸化合物, 发现随谷穗成熟叶酸总含量逐渐下降, 其中5-M-THF和10-F-FA是谷穗主要的叶酸组分。转录组分析结果进一步揭示叶酸合成关键基因表达与叶酸组分代谢相关发现,ADCS、DHFR2和GGH基因是谷穗叶酸积累的关键基因。同时, 叶酸合成基因在穗发育期存在着可变剪切的类型可能影响谷穗叶酸代谢, 明确了叶酸合成基因DHFR1/2与一碳代谢及激素信号传导途径基因之间存在的蛋白互作网络。以上结果为进一步研究单子叶植物叶酸积累的分子规律提供了新思路。

附图和附表 请见网络版: 1) 本刊网站http://zwxb.chinacrops.org/; 2) 中国知网 http://www.cnki.net/;3) 万方数据 http://c.wanfangdata.com.cn/Periodicalzuowxb.aspx。