急性肺损伤患者血浆miR-221及miR-300表达水平及与预后相关性分析*

曾宗鼎，邢崇浩，郑辉才，卓 越，李 镇，杜 莉，陈 亮，张璐璐

三亚中心医院呼吸内科，海南三亚 572000

急性肺损伤(ALI)是一种气道及肺实质内急性炎性反应的重症呼吸系统疾病，其起病急骤，病情进展迅速，病死率极高，对患者生命健康造成极大的威胁[1]。微小核糖核酸(miRNA)作为一类新型的基因调控分子，参与调控细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移和分化等过程，可通过影响靶基因的表达而调控炎症通路和免疫反应，在ALI发病过程中起重要作用[2-3]。近年来的研究发现，miR-221及miR-300在ALI中发生差异表达，有望成为治疗ALI的潜在靶点[4-5]。本研究通过检测ALI患者血浆miR-221及miR-300表达水平，探讨血浆miR-221及miR-300表达水平与ALI患者预后的关系，旨在为ALI的诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年6月三亚中心医院收治的ALI患者137例，男性87例、女性50例，年龄31～83岁，平均(56.82±10.24)岁。纳入标准：符合中华医学会呼吸病学分会制订的ALl诊断标准[6]，并结合临床症状及体征确诊。排除标准：临床诊断不明确者，合并恶性肿瘤、血液系统疾病及其他呼吸系统疾病者。本研究经本院伦理委员会批准，并与患者或家属签署知情同意书。

1.2研究方法 收集ALI患者一般资料，包括年龄、性别、体质量指数、病因、心率、呼吸频率、平均动脉压、呼气末正压、动脉二氧化碳分压及动脉血氧分压等。以ALI患者发病当天为研究起点，ALI患者痊愈出院或死亡作为研究终点，将其分为存活组(90例)和死亡组(47例)。对所有ALI患者采用急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ(APACHEⅡ)评分系统软件计算APACHEⅡ评分值，APACHEⅡ评分>20分为高危组(63例)，APACHEⅡ评分≤20分为低中危组(74例)。

1.3miR-221及miR-300检测 所有ALI患者均于发病当天采集空腹静脉血5 mL置于乙二胺四乙酸(EDTA) 抗凝管中，离心分离血浆。采用ABI 7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行实时荧光定量PCR。miRNA逆转录反应体系：5 μL RNA模板，3 μL U6及miRNA特异性茎环引物，0.15 μL 100 mmol/L脱氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00 μL逆转录酶(50 U/μL)，1.50 μL 10×反转录缓冲液，0.19 μL RNase抑制剂(20 U/μL)，4.16 μL无菌三蒸水；反应条件：16 ℃ 30 min、42 ℃ 30 min、85 ℃ 5min。PCR总反应体系为20 μL:1 μL引物及探针Mix(20×)，10 μL TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33 μL反转录产物cDNA，7.67 μL无核酸酶的水；扩增条件：95 ℃ 10 min 1个循环，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s进行45个循环。每个反应体系中荧光信号达到所设定的阈值的经历的循环数即为Ct值，采用2-ΔΔCt法计算miR-221及miR-300的表达水平。

2 结 果

2.1死亡组和存活组一般资料比较 死亡组平均动脉压、呼气末正压及APACHEⅡ评分与存活组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。两组性别、年龄、体质量指数、病因、呼吸频率、心率、动脉血氧分压及动脉二氧化碳分压比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 死亡组和存活组一般资料比较

2.2死亡组和存活组血浆miR-221及miR-300表达水平比较 死亡组血浆miR-221及miR-300表达水平均明显高于存活组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 死亡组和存活组血浆miR-221及miR-300表达水平比较

2.3高危组和低中危组血浆miR-221、miR-300表达水平及病死率比较 高危组血浆miR-221、miR-300表达水平及病死率均明显高于低中危组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

2.4多因素Logistic回归分析ALI患者死亡的危险因素 以ALI患者是否发生死亡为因变量(死亡组：Y=1，存活组：Y=0)，将存活组和死亡组有统计学意义的项目：平均动脉压、呼气末正压、APACHEⅡ评分、血浆miR-221及miR-300表达水平进行多因素Logistic回归分析，发现APACHEⅡ评分、血浆miR-221及miR-300表达水平升高是ALI患者死亡的独立危险因素，其OR(95%CI)值分别为2.490(1.583～4.206)、3.270(2.247～7.115)、2.683(1.715～6.207)。见表4。

2.5血浆miR-221及miR-300表达水平预测ALI患者死亡的价值 血浆miR-221及miR-300表达水平预测ALI患者死亡的最佳截断值分别为2.80、1.73。miR-221及miR-300二者联合预测ALI患者死亡的AUC明显高于单项miR-221、miR-300，差异有统计学意义(Z=4.426、4.705，P<0.05)，其灵敏度和特异度为92.0%和84.2%。见图1和表5。

表3 高危组和低中危组血浆miR-221、miR-300表达水平及病死率比较

图1 血浆miR-221及miR-300表达水平预测ALI患者死亡的ROC曲线

表4 多因素Logistic回归分析ALI患者死亡的危险因素

续表4 多因素Logistic回归分析ALI患者死亡的危险因素

表5 血浆miR-221及miR-300表达水平预测ALI患者死亡的价值

3 讨 论

ALI是一种病死率高、严重危害人类健康的疾病。如何早期预测ALI患者病情严重程度及预后，进而针对其进行个体化治疗，对提高临床预后及降低病死率具有重要意义。ZHENG等[7]研究表明，miRNA参与了ALI的发生、发展，在ALI炎性反应和细胞凋亡中起着重要的调控作用，将有望成为ALI的新型生物标志物和治疗新靶点。

本研究中死亡组血浆miR-221及miR-300表达水平均明显高于存活组，高危组血浆miR-221、miR-300表达水平及病死率均明显高于低中危组，差异有统计学意义(P<0.05)。这说明血浆miR-221及miR-300表达水平升高与ALI患者的病情严重程度有关，血浆miR-221及miR-300表达水平高的ALI患者预后较差，发生死亡的风险较高。WANG等[8]研究表明，ALI肺组织miR-221表达水平显著升高，miR-221的上调则加重了脂多糖诱导的肺部炎症，在ALI炎症调节中发挥重要作用。CAO等[9]研究发现，在ALI患者miRNA表达水平明显升高，且miRNA表达水平变化与ALI患者病情严重程度和预后密切相关。

本研究应用多因素Logistic回归分析，APACHEⅡ评分、血浆miR-221及miR-300水平升高是ALI患者死亡的独立危险因素。CHHANGANI等[10]研究显示，随着APACHEⅡ评分分值增高，重症患者医院感染率、住院病死率均明显升高，APACHEⅡ评分对预测重症患者的预后有一定的应用价值。本研究ROC曲线显示，miR-221及miR-300二者联合预测ALI患者死亡的AUC最大，其灵敏度和特异度较高。说明miR-221及miR-300二者联合检测有助于提高预测ALI患者死亡的价值。ZHAO等[11]研究指出，miR-221的表达增强了脂多糖刺激下促炎细胞因子的产生，可加重急性肺损伤和炎性反应，提示miR-221的异常表达参与炎症性肺疾病的发生发展。FERRUELO等[12]研究认为，miRNA是一类新的基因表达途径，在炎症或凋亡中发挥重要作用，可作为ALI诊断及预后的生物标志物。LU等[13]研究发现，miRNA与ALI的疾病发展和疾病严重性有关，可作为ALI预后评估的生物标志物，同时也为临床治疗ALI提供新的思路。但本研究为单中心的小样本研究，其结论可能存在一定的片面性和局限性，今后仍需更多的临床研究来证实。

血浆miR-221及miR-300表达水平升高与ALI患者预后不良相关，是ALI患者死亡的独立危险因素，有望作为预测ALI患者预后的新型生物标志物。