微滴式数字PCR与IHC联合FISH对乳腺癌新辅助化疗前后HER-2检测的分析

彭 燕，郑细闰，刘红英，何青莲，郑广娟

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一[1]。术前新辅助化疗在局部晚期乳腺癌患者的治疗中发挥了重要作用，并取得了较好的临床疗效[2]。HER-2是位于17号染色体上的跨膜蛋白，具有跨膜酪氨酸激酶活性，10%～25%的乳腺癌组织中可以检测到HER-2蛋白过表达[3-4]，因此HER-2基因在乳腺癌发生、发展过程中发挥了重要的作用。目前，临床常用的检测方法主要为免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)及荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)，虽广泛运用但仍存在一定判读问题[5]。微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)是一种检测核酸分子的绝对定量技术，其运用直接的计数目标基因和参照基因(已知拷贝数)数目，通过计算其比值，就可得到目标基因的拷贝数[5]。本实验利用ddPCR技术检测乳腺癌新辅助化疗前后的HER-2扩增情况，并与IHC联合FISH检测这一传统检测方法进行结果对比，验证ddPCR检测的可行性，为临床选择该检测方法提供可靠性。

1 材料与方法

1.1 临床资料本实验通过广州中医药大学第二附属医院住院病历系统及朗伽病理系统收集了确诊为乳腺浸润性导管癌患者62例(术前均未接受放、化疗及内分泌治疗、靶向药物等新辅助治疗的穿刺活检组织和经过规范新辅助化疗后的手术根治标本)纳入实验，编号为1、2、3……62，患者均为女性，年龄28～82岁，平均(52±12.85)岁。

1.2 仪器与试剂常规仪器有全自动免疫组化仪、StatSpin杂交仪，Droplet Digital PCR系统、T100热循环仪、PX1 PCR plate Seale及微滴控制分析软件。试剂主要有Ultra View DAB检测试剂盒和HER-2抗体均由罗氏诊断公司提供，FISH检测试剂盒由北京金菩嘉医疗公司提供，ddPCR试剂盒由伯乐生命医学产品(上海)公司提供。

1.3 方法乳腺癌标本离体后立即经10%中性福尔马林固定6～24 h，按照病理科流程常规脱水，石蜡包埋，连续4 μm厚切片4～10张。

1.3.1IHC 采用Bench Mark XT全自动免疫组化仪对HER-2进行检测，HER-2积分为2+的不确定病例则按试剂盒说明书操作进行FISH检测。

1.3.2ddPCR检测 根据试剂盒说明操作将样本提取和纯化DNA，将含有样品的20 μL DNA反应液置于微滴发生器的样品孔中并加入70 μL微滴生成油使其生成纳升级的油包水液滴，之后取40 μL转入96孔板中用铝箔热封膜密封，置于Bio-Rad C1000热封膜仪上，进行40个常规的PCR扩增反应循环，最后利用检测仪自带控制分析软件进行荧光检测和数据分析。

1.4 HER-2结果判读

1.4.1IHC染色结果评估 参照我国《乳腺癌HER-2检测指南(2019版)》[6]：肿瘤细胞无着色为0；>10%癌细胞呈不完整的微弱细胞膜染色为1+；>10%癌细胞呈完整弱至中等强度的细胞膜染色或≤10%浸润癌细胞呈强而完整的细胞膜染色为2+；>10%癌细胞呈强且完整、均匀的细胞膜着色为3+。结果判读：0～1+为阴性，2+为可疑阳性，3+为阳性。

1.4.2FISH结果判读 参照我国《乳腺癌HER-2检测指南(2019版)》[6]：(1)平均HER-2拷贝数/细胞<4.0判为FISH阴性。(2)HER-2/CEP17比值<2.0，平均HER-2拷贝数/细胞≥6.0判为FISH阳性。(3)HER-2/CEP17比值<2.0，4.0≤平均HER-2拷贝数/细胞<6.0，此种情况建议重新计数至少20个细胞核信号，如果结果改变，则对2次结果进行综合判断分析。如仍为上述情况，需要在FISH报告中备注：此类患者HER-2状态的判断需结合IHC结果。(4)HER-2/CEP17比值≥2.0；平均HER-2拷贝数/细胞≥4.0判为FISH阳性。若平均HER-2拷贝数/细胞<4.0则增加计数细胞，如果结果维持不变，则判为FISH阴性。目前对于平均HER-2拷贝数/细胞<4.0判为FISH阳性尚有一些争议，建议临床医师重复阅片或增加一名临床医师阅片，结果参考IHC检测结果，同时对患者进行沟通。

1.4.3ddPCR的结果判读 用CNV表示HER-2拷贝数/细胞的比值，CNV≥3.2为阳性，CNV<3.2为阴性[7]。

1.5 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，对穿刺标本和手术根治标本行ddPCR检测与IHC联合FISH检测HER-2结果符合率用κ法分析其一致性；κ>0.75，P<0.01，认为两法检验一致性较好。

2 结果

2.1 乳腺癌新辅助化疗前的穿刺活检标本结果

2.1.1穿刺活检标本HER-2的检测结果 62例穿刺活检标本中，IHC检测结果HER-2阴性有33例，可疑阳性有15例，阳性有14例(图1)；HER-2可疑阳性标本FISH检测有9例为阴性，6例为阳性(图2)；即IHC联合FISH检测HER-2阴性有42例，阳性有20例。ddPCR检测HER-2阴性有37例，阳性有25例(图3)。

2.1.2穿刺活检标本的ddPCR与IHC联合FISH检测HER-2结果对比 穿刺活检标本HER-2检测结果：ddPCR与IHC联合FISH检测均为阳性有19例，均为阴性有36例；其中6例ddPCR检测阳性，而IHC联合FISH检测为阴性；1例ddPCR检测阴性，IHC联合FISH检测为阳性。两种方法检测结果，一致性好(κ=0.758，P<0.01，表1)。

表1 穿刺活检标本的ddPCR与IHC联合FISH检测HER-2结果对比

2.2 乳腺癌新辅助化疗后的手术根治标本结果

2.2.1手术根治标本HER-2的检测结果 62例手术根治标本中，IHC检测HER-2阴性有25例，可疑阳性有23例，阳性有14例；HER-2可疑阳性标本FISH检测有17例为阴性，6例为阳性；即IHC联合FISH检测HER-2阴性有42例，阳性有20例。ddPCR检测HER-2阴性有40例，阳性有22例(图4)。

图1 IHC染色HER-2结果：A.0；B.1+；C.2+；D.3+ 图2 FISH检测HER-2结果；红色信号为HER-2基因，绿色信号为17号染色体；A.HER-2阴性；B.HER-2阳性；C.HER-2可疑阳性需参考IHC结果；D.HER-2簇状阳性

图3 ddPCR法检测穿刺活检标本HER-2的结果

图4 ddPCR法检测手术根治标本HER-2的结果

2.2.2手术根治标本的ddPCR与IHC联合FISH检测HER-2结果对比 手术根治标本HER-2检测结果：ddPCR与IHC联合FISH检测均为阳性有18例，均为阴性有38例；其中4例ddPCR检测阳性，IHC联合FISH检测为阴性；2例ddPCR检测为阴性，IHC联合FISH检测为阳性。两种方法检测结果，一致性好(κ=0.784，P<0.01，表2)。

表2 手术根治标本的ddPCR与IHC联合FISH检测HER-2结果对比

3 讨论

HER-2和肿瘤细胞的生长、转移和侵袭密切相关，是乳腺癌用于预后的重要判断因子及靶点治疗的指标，因此HER-2状态的检测在临床中显得尤为重要。尤其对筛选靶向药物获益患者尤为重要[8]，有利于乳腺癌患者的个体化治疗。

本组实验结果显示，乳腺癌新辅助化疗前后的标本行ddPCR与IHC联合FISH检测HER-2的结果一致性好。IHC是通过检测组织细胞内各种抗原物质的一种检测方法，具有快速简便、特异性好、敏感性高等优点，但结果易受到内环境温度、抗体滴度、人为操作、病理医师的主观判读等因素影响造成假阴性或假阳性。FISH虽然相对稳定但检测费用较高、荧光易淬灭且操作繁琐，容易造成信号丢失导致结果假阴性；除此之外，有研究显示，部分乳腺癌中17号染色体存在着HER-2基因和着丝粒的共同扩增[9]，导致医师在判读中受到一定影响。而ddPCR检测结果准确可信且操作简单、方便快速、结果直观明了，大幅度降低了病理医师的工作量。

另外本实验亦发现部分标本存在结果差异性，特别是穿刺标本中有6例ddPCR检测为阳性，IHC联合FISH检测为阴性；导致的原因主要有：(1)主要依靠临床医师根据B超的定位进行穿刺，具有一定的主观局限性；(2)细胞数量少或肿瘤细胞存在异质性，导致检测样本无法进行刮取有效的肿瘤细胞且不可避免取到紧邻肿瘤组织的正常组织或炎症细胞；因此产生其结果的差异性。由于本次实验样本量有限，需要更多的临床实验数据进行大样本量的分析，进一步论证行ddPCR检测HER-2结果的可靠性。

综上所述，在乳腺癌新辅助化疗中采用ddPCR技术检测HER-2基因是可行的。尽管IHC染色快速简便、易保存、费用低但检测结果准确性仍需提高；FISH检测准确性较高，但耗时长、操作繁琐且荧光易淬灭，不易长期保存；ddPCR技术则弥补了IHC和FISH的局限性，并且快速简便、耗时短、结果直观，因此对IHC与FISH检测结果不一致性时[10]，临床及病理科可以运用ddPCR技术加以验证此标本中HER-2基因的扩增状态。但由于本实验纳入检测标本有限，仍需要扩大实验标本量，为临床提供更有力的证据。