颅底良性脊索肿瘤恶变临床病理与分子遗传学特征分析

杜 江，崔 云，苏玉金，刘朝霞，徐作霖，熊志霞，李桂林

良性脊索肿瘤(benign notochordal cell tumour, BNCT)临床比较少见，WHO(2013)骨及软组织肿瘤中将其作为新分类肿瘤被收录。BNCT和脊索瘤均被认为起源于脊索组织，两者在影像学、组织学及免疫组化染色上均有重叠[1]。有文献报道[2]两种肿瘤可共存，也有观点认为BNCT可以恶变为脊索瘤[3]，是脊索瘤的前期病变[4]。目前，脊索瘤拷贝数的变化表现为染色体1、2、3、5、6、7、9、10、13、14、17、20、22的变化[5]，但尚缺乏关于BNCT拷贝数变化的研究。OncoScan全基因组拷贝数分析可用于福尔马林固定的石蜡包埋标本，其敏感性和特异性较高[6]，可用于分析肿瘤组织的拷贝数变化。

1 材料与方法

1.1 标本收集2009年5月1日～2013年4月31日北京市神经外科研究所神经病理室诊断的1例BNCT，肿瘤复发2次，最终恶变为经典型脊索瘤。该患者男性，38岁，肿瘤位于鼻咽部、斜坡骨质和鞍区。第1次行近肿瘤完整切除，术后病理诊断为BNCT，5个月后复发，行部分切除，术后病理仍诊断为BNCT。40个月后，患者再次复发，术后病理诊断为经典型脊索瘤。标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，由两位有经验的病理医师进行诊断。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 免疫组化染色采用EnVision两步法，pH 8.0 EDTA高压锅抗原修复。一抗采用单克隆抗体工作液[vimentin、CK(AE1/AE3)、CK8/18、EMA、p53、S-100蛋白和Ki-67核抗原]。一抗采用单克隆抗体Brachyury蛋白(稀释比1 ∶500，Abcam公司，英国)，所有工作液的试剂均购自Invitrogen公司(格兰德艾兰公司，美国)，并应用SuperPicture 3rd Gen免疫组化检测试剂盒。本实验分别设立阴、阳性对照，阳性为细胞膜、细胞质、细胞核呈棕黄色颗粒；阴性为细胞膜、细胞质、细胞核未出现棕黄色颗粒。

1.2.2OncoScan拷贝数分析 基因组DNA的提取来自于4 μm厚的石蜡包埋组织切片，经病理组织学证实为肿瘤实质部分。DNA提取：采用Qiagen DNA石蜡包埋组织试剂盒(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, Qiagen, 56404)。用Qubit分光光度计和NANODROP分光光度计分别测定DNA的浓度和纯度。DNA吸收比A260/A280在1.8～2.0之间，最小浓度为12 ng/μL，总质量为80 ng判定为合格样本，每份样本以80 ng肿瘤组织DNA进行分析，采用Mip探针，应用OncoScan检测进行全基因组拷贝数分析。样本分析过程依据Affymetrix使用说明书。检测后生成的文件通过OncoScan Console软件(Biodiscovery有限公司，加利福尼亚州，美国)和OncoScan Nexus Express软件3.0版本(Biodiscovery有限公司，加利福尼亚州，美国)进行转换和分析。

2 结果

2.1 临床及影像学特点患者男性，首次发病年龄38岁，临床表现为头痛5个月，随后出现听力下降2个月。MRI检查示肿瘤大小5.7 cm×4.2 cm×6.6 cm，位于鼻咽部、斜坡骨质和鞍区。病灶表现为T1低信号(图1A)和T2高信号，且有不规则增强。行内镜下鞍区肿瘤切除术，近完整切除，鼻窦内有少量残留。术后未采取放疗。5个月后患者出现鼻塞，再次行经蝶内镜下鞍区肿瘤切除术。40个月后，经复查发现肿瘤增大。患者左眼外展受限伴复视8个月，左侧咀嚼无力2个月，MRI检查显示T1低信号，T2高信号，手术区域的边缘出现明显的对比增强(图1B)。术后行放疗，24个月时随访未见患者复发。

图1 A.第1次BNCT术前MRI检查示肿瘤大小5.7 cm×4.2 cm×6.6 cm，位于鼻咽部、斜坡骨质和鞍区，T1低信号；B.第3次手术切除脊索瘤，术前MRI检查示手术边缘部位，肿瘤再生长，T1出现明显对比增强

2.2 病理特征第1次术后标本，病理诊断为BNCT。镜下见肿瘤缺乏细胞外基质，瘤细胞空泡状，细胞核位于边缘部，无核分裂象(图2A)。第2次术后标本镜下显示肿瘤的绝大部分形态仍然为BNCT，仅偶见胞质嗜酸的肿瘤细胞。第3次术后标本镜下显示绝大部分的肿瘤组织学形态为经典型脊索瘤。肿瘤细胞胞质空亮或嗜酸，条索状排列，周围有丰富的黏液样间质(图2B)。此外，仍有部分区域表现BNCT的特征，但该区域的空泡细胞密度有所增加，并且空泡细胞大小不一，肿瘤细胞核位于细胞中央。

2.3 免疫表型BNCT中Brachyury呈局灶阳性，脊索瘤中Brachyury呈弥漫强阳性(图2C)。Ki-67增殖指数为10%(图2D)。3次手术标本中的CK、CK8/18、EMA、vimentin、S-100、p53表达无差异(表1)。

图2 A.第1次术后标本，镜下见BNCT无细胞外黏液样基质，肿瘤细胞空泡状，核位于周边部，类似于成熟的脂肪细胞；B.第3次术后标本，镜下见经典型脊索瘤结构，肿瘤细胞胞质嗜酸，条带状分布于丰富的黏液样基质中；C.第3次术后标本免疫组化标记Brachyury弥漫强阳性，EnVision两步法；D.第3次术后标本Ki-67增殖指数为10%，可见阳性的异型细胞，EnVision两步法

表1 BNCT及其向脊索瘤转化标本中蛋白免疫表型

2.4 OncoScan检测第1次手术切除的BNCT标本及第3次手术切除的脊索瘤标本分别进行OncoScan检测，两次检测结果存在一些差异性的拷贝数变化(图3)。

本例BNCT和脊索瘤同时存在一些拷贝数的获得，主要包括：1q21.1-q44、6q11.1-q27、7p22.3-q36.3、12p12.3-q24.13、12q24.2-24.33、16p12.3。另外，脊索瘤特有的拷贝数丢失区域包括：3p25.3-p25.2、3p22.3-p22.2、3p21.31-p12.3、3p12.3-q11.1、3q11.2、3q13.2-q25.1、3q26.1、3q26.33-q27.2、9q21.32-q21.33、21q21.2、21q21.3、21q22.12-q22.3。另外有9p的杂合性缺失，包括9p24.3-p22.3、9p22.1-p21.2、9p21.1-p13.1。

3 讨论

本例BNCT恶变为经典型脊索瘤的病例为国内首次报道，也是首次对BNCT恶变病例进行了全基因组拷贝数的检测。BNCT被WHO(2013)骨及软组织肿瘤分类所收录[7]，其与脊索瘤的起源相同，预后较好，应与脊索瘤区分。但有文献报道，BNCT可以向脊索瘤转化[3]，也有非典型BNCT的报道，提示BNCT和脊索瘤的成分可以混合存在[2]。

BNCT中MRI检查示T1低信号和T2高信号，与脊索瘤相同，但脊索瘤显示T1对比增强[8]，而大部分BNCT无对比增强[3]。本例恶变为脊索瘤标本MRI检查示明显的对比增强。

组织学上BNCT最主要的特征是缺乏细胞外黏液样间质，肿瘤细胞空泡样[9]。无非典型性，无核分裂和坏死。脊索瘤则为黏液样间质中散在条索样的肿瘤细胞，肿瘤细胞胞质透明或嗜伊红。肿瘤细胞可显示不同程度的非典型性，可见核分裂象和坏死[7]。随着肿瘤的复发，本例组织病理学特征显示从BNCT到脊索瘤的转变。免疫组化染色示BNCT中Ki-67增殖指数约1%，而脊索瘤中Ki-67增殖指数高达10%，这也提示了肿瘤的恶性进展。Brachyury基因位于6q27，是脊索组织分化过程中重要的T基因转录因子，属于T基因家族成员，其可以调控下游多个信号通路，构成分子网络[10]。在Miettinen等[11]的研究中，53例脊索瘤中Brachyury蛋白均阳性，目前认为其是脊索瘤高度特异的标志物，有助于脊索瘤与其它间胚叶来源的肿瘤鉴别，包括软骨肉瘤。在本例脊索瘤中Brachyury显示为弥漫阳性，BNCT中为局灶阳性，部分区域阴性。Shen等[12]报道Brachyury在脊索瘤中阳性，但在脊索瘤周边的BNCT区域则为阴性，并且在胎儿脊索细胞巢(notochordal cell rests, NCR)中阴性，在组织学上胎儿NCR与BNCT形态相似，提示在BNCT中Brachyury阴性区域可能与NCR有关。脊索瘤通常具有较低的突变率，是C类(染色体拷贝数变化)肿瘤，其致癌特征是非随机多重拷贝数丢失[13]。本实验OncoScan全基因组拷贝数分析显示BNCT中拷贝数的获得更常见。在恶变为脊索瘤时，则出现比较大片段的拷贝数缺失，这与一些脊索瘤的文献报道一致，即脊索瘤易表现为拷贝数的缺失[14]。但本例同时保留BNCT拷贝数获得的特点，在此基础上出现3p、3q的大片段缺失和9p、9q、21q的部分缺失。一些研究认为脊索瘤的进展可能依赖于拷贝数丢失介导的分子机制[13,15]。本组在3号染色体的大片段缺失涉及的主要基因包括：SRGAP3、FANCD2、VHL、PPARG、RAF1、XPC、MLH1、MYD88、CTNNB1、SETD2、BAP1、PBRM1、FHIT、MITF、FOXP1、CBLB、GATA2、RPN1、FOXL2、WWTR1、GMPS、MLF1、EVI1、PIK3CA、SOX2、ETV5、BCL6、LPP、TFRC。曾有研究认为脊索瘤出现拷贝数变化可能与以下原因有关，在3p21.1-p21.31处的8 Mb段内，3个癌症相关染色质重塑和推测的抑癌基因位于此处，为SETD2、BAP1和PBRM1基因[13]。在作者观测的BNCT恶变病例中，也出现了这一区段的缺失，导致上述基因的缺失。本例BNCT恶变病例中，出现3号染色体多个片段的丢失则与Szuhai等[15]报道一致，认为3号染色体的丢失是脊索瘤发生中的早期事件。

图3 第1次手术切除样本和第3次手术切除样本的OncoScan染色体拷贝数分析：A.BNCT样本主要显示1、6、7、12、16、17号染色体的拷贝数获得；B.脊索瘤样本显示增加了大片段的3号、21号染色体和部分9号染色体的拷贝数缺失；0基线上方线段为拷贝数获得染色体片段，基线下方线段为拷贝数缺失片段

9号染色体的缺失片段基因包括JAK2、CD274、NFIB、MLLT3、FANCG、PAX5、CDKN2A、CDKN2B，其中CDKN2A/B已经在多种肿瘤中证实与患者预后不良相关，在脊索瘤的研究中也有报道[16]。

本例脊索瘤标本中出现染色体3p、3q的缺失和9p杂合性缺失，提示其可能是脊索瘤发生的早期事件。同时，也提示BNCT可以恶变为脊索瘤，关于3p、3q、9p的缺失在脊索瘤发生、发展中的作用机制尚待进一步分析，可能与其导致众多基因缺失促进了肿瘤的增殖有关。