子宫颈病变中Nrf2和Keap1蛋白的表达及与预后的关系

银 萍，徐福霞，王志强，杨 珺

子宫颈癌是影响妇女健康的最常见肿瘤，2018年WHO统计报道，全球每年新增约50万例子宫颈癌患者，且发病呈年轻化趋势。子宫颈病变尤其是子宫颈癌早期即出现侵袭和转移，其发病机制尚不清楚，除与人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染有关外，近年研究表明子宫颈癌的发生与子宫颈细胞染色体和miRNA异常改变有关[1]。肿瘤在发生过程中患者机体出现氧化应激反应，且多处于高水平氧化应激状态[2]。目前有很多针对肿瘤患者机体氧化应激的代谢反应，产生协同抗肿瘤反应的治疗报道[3]。研究表明[4]，子宫颈病变患者机体抗氧化系统平衡障碍，患者机体存在过氧化现象。氧化应激的关键转录活性因子核因子E2相关因子(NF-E2-related factor 2, Nrf2)可结合Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-related protein 1, Keap1)，恢复机体氧化失衡的状态[5-6]。研究表明Nrf2/Keap1通路是在机体抗氧化中起保护性作用的关键通路。在关于子宫颈病变的机制分析中，检测两者表达与子宫颈病变关系的报道较少。本文采用免疫组化SP法检测子宫颈上皮内病变和子宫颈癌组织中Nrf2、Keap1蛋白的表达，着重探讨两者在子宫颈病变中的意义及与患者预后的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2012年9月～2017年8月安徽省第二人民医院存档的67例子宫颈癌手术标本，患者均未合并其他心、肝、肺、脑等重要脏器的严重病变，患者术前均未行放、化疗，术后病理诊断均确诊为子宫颈癌，根据2016年国际妇产科联盟(FIGO)子宫颈癌分期，将67例子宫颈癌分为：Ⅰa期21例，Ⅰb期24例，Ⅱa期22例。病理类型：子宫颈鳞状细胞癌51例，其中高分化12例，中分化20例，低分化19例；腺癌16例，其中高分化3例，中分化6例，低分化7例。另收集同期20例行子宫颈锥切的子宫颈上皮内病变标本。患者年龄31～72岁，中位年龄48岁。术后子宫颈组织常规固定，石蜡包埋。本实验经安徽省第二人民医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 主要试剂一抗：羊抗人Nrf2多克隆抗体(浓缩型，ab137550)、兔抗人Keap1多克隆抗体(浓缩型，ab226997)，均购于美国Abcam公司；抗原修复液、山羊血清、通用型二抗、DAB显色剂、苏木精、PBS缓冲液、中性树脂，均购自福州迈新公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 免疫组化免疫组化染色采用SP法。将子宫颈组织置于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋，4 μm厚切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇浸泡，微波抗原修复，血清抗原封闭，滴加一抗(羊抗人Nrf2多克隆抗体，稀释比1 ∶300；兔抗人Keap1多克隆抗体，稀释比1 ∶200)，4 ℃冰箱中孵育过夜；次日，PBS清洗10 min×3次，每片滴加即用型二抗50 μL，37 ℃温箱中孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固，镜检。

1.4 结果判断Nrf2、Keap1蛋白免疫组化染色结果由3名病理医师独立判定，参照文献进行定性和计分[6]，阳性细胞为细胞质呈黄色或棕黄色；每张切片镜下(40×)随机观察5个视野，根据阳性细胞百分比计分：<10%为0分；10%～25%为1分；26%～50%为2分；50%～75%为3分；>75%为4分。按照阳性细胞染色程度计分：无着色为0分；浅黄色为1分；黄色为2分；棕褐色为3分。将两项得分结果相乘：>4分为高表达；1～4分为低表达；0分为阴性。

1.5 随访67例子宫颈癌患者随访包括门诊复查、电话和微信等，患者生存期以手术日开始计算，截至2020年8月，随访4～72个月，中位时间为40个月，其中有5例患者失访，8例患者死亡，1例Ⅰa期、3例Ⅰb期、4例Ⅱa期患者。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验分析Nrf2、Keap1蛋白表达与子宫颈癌临床病理特征的关系，采用Wilcoxon秩和检验分析Nrf2、Keap1蛋白表达，子宫颈癌组织中蛋白表达与患者生存期的关系采取Kaplan-Meier分析，患者生存率曲线采取Log-rank检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同子宫颈病变组织中Nrf2、Keap1蛋白的表达免疫组化结果显示，Nrf2蛋白表达主要定位于细胞质，呈浅～棕黄色(图1)。随着子宫颈癌组织病理分期的升高，Nrf2表达逐渐升高(表1)。Ⅰb、Ⅱa期子宫颈癌组织中Nrf2的表达与子宫颈上皮内病变组织相比，差异有显著性(P<0.05)。Keap1蛋白表达主要定位于细胞质、细胞核，呈浅～棕黄色(图2)。随着子宫颈癌组织病理分期的升高，Keap1蛋白表达逐渐降低，与上皮内病变组织相比，差异有显著性(P<0.05，表1)。

图1 不同子宫颈病变组织中Nrf2蛋白均呈阳性，SP法：A.子宫颈上皮内病变；B.子宫颈癌Ⅰa期；C.子宫颈癌Ⅰb期；D.子宫颈癌Ⅱa期 图2 不同子宫颈病变组织中Keap1蛋白均呈阳性，SP法：A.子宫颈上皮内病变；B.子宫颈癌Ⅰa期；C.子宫颈癌Ⅰb期；D.子宫颈癌Ⅱa期

表1 不同子宫颈病变组织中Nrf2与Keap1蛋白的表达[n(%)]

2.2 Nrf2和Keap1蛋白表达与子宫颈癌临床病理特征的关系统计结果显示，子宫颈癌组织中Nrf2、Keap1蛋白表达与患者年龄、肿瘤生长方式(外生、内生、糜烂、溃疡型)、肿瘤直径，以及FIGO临床分期无相关性(P>0.05)，与肿瘤浸润程度(深肌层浸润明显高于无深肌层浸润)、组织学分级、淋巴结转移有相关性(P<0.05，表2)。

表2 Nrf2和Keap1蛋白表达与子宫颈癌临床病理特征的关系

2.3 Nrf2和Keap1蛋白表达与子宫颈病变患者预后的相关性本组67例子宫颈癌患者有5例失访，死亡8例(其中Ⅰa期1例、Ⅰb期3例、Ⅱa期4例)，随访4～72个月。Nrf2蛋白阴性、低表达、高表达的患者病死率分别为0(0/18)、8.0%(2/25)、25.0%(6/24)。Keap1蛋白阴性、低表达、高表达的患者病死率分别为16.7(5/30)、7.1%(2/28)、11.1%(1/9)。Log-rank检验表明，Nrf2和Keap1蛋白表达水平不同，患者生存率差异有显著性(χ2=7.623、7.988，P<0.05，图3)。

图3 Kaplan-Meier生存曲线显示子宫颈病变组织中Nrf2(A)和Keap1(B)蛋白表达与患者生存率的关系

3 讨论

子宫颈癌的病死率仅次于乳腺癌，全球每年约50万新发病例，我国每年约有14万例，其严重危及女性的生命安全[1]。目前，子宫颈癌的发病机制尚不清楚，探明其发病机制可为治疗提供新的诊断和治疗依据。子宫颈癌患者早期症状不典型，晚期患者出现全身衰竭，生活质量急剧下降，故早期诊疗并预防癌变显得极为重要。研究表明，HPV感染是导致患者子宫颈癌的重要因素之一，HPV的E2基因可以整合到宿主DNA中，破坏子宫颈上皮细胞基因的完整性，使其癌变风险提高[7]。HPV致癌蛋白E2、E6可以和氧化应激相互协同作用，引起DNA氧化，损伤子宫颈上皮细胞，并使得癌变后的子宫颈上皮细胞凋亡受抑制，因而贯穿着子宫颈癌的发病过程。HPV感染是导致子宫颈癌的重要致病因素，子宫颈上皮持续暴露、HPV感染与氧化应激协同作用下，子宫颈上皮细胞与病毒基因组重新整合，升高子宫颈上皮细胞基因组的不稳定性，引起子宫颈上皮致瘤风险，加速病毒DNA整合和肿瘤细胞增殖，同时可以降低肿瘤细胞的凋亡[8]。体内、体外实验均证实[9]，子宫颈癌患者机体活性氧簇浓度增加，引起DNA氧化损伤，加速与病毒基因组整合。氧化应激可能导致DNA、RNA和蛋白质损伤，导致细胞恶性转化基因的累积，氧化应激与高危HPV慢性炎症有协同作用，机体为对抗氧化应激，会产生保护性抗氧化防御，以维持氧化还原平衡。HPV感染导致子宫颈癌，其致癌性存在氧化应激的协同作用，本文探讨氧化应激与子宫颈病变发生和预后的关系。

信号通路转导失调、癌基因激活等存在于子宫颈癌的发病机制中[10-11]。Nrf2是反映机体中氧化应激的关键转录因子，能够调节抗氧化酶，Keap1是负调控Nrf2因子，在机体内两者可以结合，从而泛素化降解Nrf2蛋白，使正常机体中Nrf2处于低水平状态[12]。本实验也证实在子宫颈上皮内病变组织中Nrf2蛋白阳性率低于子宫颈癌组织，而Keap1蛋白阳性率在子宫颈上皮内病变组织中较高，随着上皮内病变向低分化子宫颈癌病变的发展，在氧化应激刺激后，会破坏细胞中Keap1蛋白的半胱氨酸巯基，降低Nrf2与Keap1结合，加剧两者的解离，使靶基因的转录加快，抗氧化作用更为明显。Nrf2/Keap1信号通路可能参与HPV的致癌性，并协同调节氧化应激[13]。通过降低机体活性氧含量，减轻对子宫颈上皮DNA氧化受损，防止子宫颈上皮细胞发生恶变。本实验分析Nrf2和Keap1蛋白与子宫颈癌临床病理的关系，结果显示，Nrf2和Keap1蛋白表达与子宫颈癌患者年龄、子宫颈癌类型和大小、FIGO临床分期等无相关性，但与组织学分级、深肌层浸润、淋巴结转移等有相关性，Nrf2/Keap1在子宫颈病变中的不同表达，反映该信号通路在子宫颈上皮内病变至子宫颈癌发展进程中起一定作用。同时，虽然与子宫颈上皮内病变相比，子宫颈癌组织中Nrf2和Keap1蛋白表达差异有显著性，但本组不同临床分期之间蛋白表达差异无显著性，有待进一步收集病例，得出更加明确结论。同时，Nrf2和Keap1蛋白表达与子宫颈病变患者预后有一定的相关性，Nrf2蛋白表达升高、Keap1蛋白表达降低，往往提示患者病死率高，两者联合检查可能在子宫颈癌患者预后中有一定的价值。

综上所述，氧化应激Nrf2和Keap1蛋白在子宫颈上皮内病变和子宫颈癌Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa期表达不同，随着子宫颈病变病理分级升高，Nrf2蛋白表达呈上升趋势，Keap1蛋白表达呈下降趋势，且Keap1蛋白表达与肿瘤肌层浸润、有无淋巴结转移等有相关性。两种蛋白的表达，可能与子宫颈癌病变的发生、发展及患者预后相关。