建立优化的术中快速免疫组化检测体系

高少阳，王明伟，张 盛，岳君秋，常 青

术中快速病理诊断是辅助临床医师在术中明确肿瘤良恶性、决定手术方式的重要手段，病理切片经HE染色在镜下观察细胞形态、组织学特征，并进行快速诊断。由于HE染色切片因其自身局限性、制片过程中造成假象等可能导致误诊，难以确诊疑难病例，有较大的医疗风险。术中对冷冻切片进行快速免疫组化染色，可提高术中快速病理诊断的准确性。目前，文献报道的术中快速病理诊断在技术步骤、效果、时长、成本等各有优缺点[1-3]。本科室在实践工作中建立快速手工免疫组化检测体系，用于术中辅助诊断疑难病例，取得良好效果，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料收集16例冷冻切片(经HE染色难以确诊的疑难病例)，其中10例乳腺导管原位癌伴/不伴微小浸润，3例乳腺硬化性腺病，3例低分化癌。另收集2例乳腺纤维腺瘤作为对照，留取组织标本或切片进行术中快速免疫组化染色。

1.2 试剂(1)实验室自配AAF固定液(95%乙醇85 mL、甲醛10 mL、乙酸5 mL)，PBS缓冲液(pH 7.3，北京中杉金桥公司)。(2)快速免疫组化一抗和石蜡切片免疫组化一抗试剂详见表1、2。二抗显色系统采用EnVision FLEX酶标二抗及DAB工作液；p63、CKpan采用Leica BOND-MAX全自动免疫组化仪进行染色，二抗及显色系统为Leica Bond显色试剂套装；Calponin采用DAKO自动染色机Link48和EnVision FLEX检测系统进行染色。

1.3 主要仪器全自动免疫组化仪BOND-MAX/Leica，Autostainer Link48/DAKO等。

1.4 方法

1.4.1术中快速手工免疫组化 (1)新鲜组织于-20 ℃速冻后4～6 μm厚切片，固定液(AAF或冷丙酮)固定1 min，经PBS冲洗5 s，丙酮固定组织室温晾干5～10 s；(2)滴加一抗于37 ℃孵育5 min，PBS冲洗5 s×3次；(3)滴加酶标二抗试剂37 ℃孵育5 min，PBS冲洗5 s×3次；(4)DAB显色37 ℃ 1 min，水洗5 s；(5)苏木精复染8～10 s，水洗5 s；(6)梯度脱水，封固。

表1 术中快速免疫组化一抗试剂

表2 石蜡切片免疫组化一抗试剂

1.4.2术后石蜡切片全自动免疫组化 术中快速制片的组织以及剩余组织再取材，均经10%中性福尔马林固定，梯度脱水、透明浸蜡、石蜡包埋、制片、脱蜡、高压修复后，行免疫组化EnVision法染色，具体染色步骤按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 不同固定液的比较本实验选用术中新鲜取材的乳腺导管原位癌组织行p63和Calponin检测，选用低分化癌组织进行CKpan检测；同一组织切片后分别用AAF和冷丙酮进行固定，再行免疫组化EnVision法染色。结果显示：两组切片中p63(图1)、Calponin和CKpan均阳性，而冷丙酮固定组阳性强度更高。

2.2 一抗浓度的比较本实验选用术中快速送检的不同组织进行一抗浓度梯度实验：乳腺硬化性腺病(p63，1 ∶150～1 ∶300)，乳腺纤维腺瘤(Calponin，1 ∶100～1 ∶400)和低分化癌(CKpan，1 ∶50～1 ∶400)。结果表明：浓度较高组信号强度更有利于判读(图2)，但需注意观察组织内阴性区域是否明确，避免一抗浓度过高导致的假阳性。

2.3 快速免疫组化和石蜡切片免疫组化分析使用优化的术中快速免疫组化染色技术，对新鲜冷冻切片进行p63、Calponin和CKpan染色，结果表明：p63、Calponin对肌上皮的标记和CKpan对低分化癌的标记均定位较明确，术中快速免疫组化和术后石蜡切片的免疫组化结果一致。

图1 A.AAF固定组：乳腺导管内癌组织中p63呈阳性，EnVision法;B.丙酮固定组：乳腺导管内癌组织中p63呈阳性，EnVision法 图2 A.冷冻切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶50稀释组)染色，EnVision法;B.冷冻切片：胸膜低分化癌中CKpan(1 ∶400稀释组)染色，EnVision法

3 讨论

3.1 术中快速免疫组化注意事项(1)固定液的使用：本实验发现冷丙酮固定的冷冻切片显色度最强，与冷丙酮渗透力强[4-5]、抗原保护作用强有关。另外其与组织温差较小，滴加到组织上进行固定，可以更好的保护抗原，效果优于AAF固定液。丙酮还具有快速挥发特点，可以快速晾干切片，无需PBS溶液冲洗可提高一抗的孵育浓度，并节省实验时间。(2)免疫组化操作：孵育温度、抗体浓度、足量的抗体覆盖是实验成功的关键。由于快速免疫组化抗体孵育时间仅为5 min(常规石蜡切片孵育时间为1～1.5 h)，因此孵育温度必须尽快达37 ℃，并在孵育过程中保证温度稳定，通常将湿盒预先在37 ℃孵箱中预热，并在孵育过程中轻轻震荡混匀。一抗浓度需高于常规石蜡切片的一抗浓度，根据检测指标表达的不同，快速免疫组化一抗浓度甚至要达到常规使用浓度的5～10倍。另外，需保证滴加试剂的量完全覆盖切片的组织为宜，一般需要150～200 μL。因为抗体浓度对阳性强度影响较大，滴加一、二抗试剂前应将PBS冲洗液尽量吸干，以避免抗体试剂被稀释造成染色不佳或不着色。一抗需要选择适用于冷冻切片的抗体，个别实验抗体仅适用于石蜡切片，用于冷冻切片则显示实验失败，实验前需进行预实验来确定最佳固定液及抗体浓度。

3.2 术中快速免疫组化的优缺点分析本组优化后的实验方法不需要准备特殊的抗体及其它化学试剂和设备，在日常的术中快速病理诊断过程中，可以根据组织来源并结合HE形态，挑选1～2种抗体进行快速免疫组化染色，染色耗时约15 min。个别脂肪含量高难以切片或要求定点切疑似浸润区域的组织，可以先与手术医师沟通，告知初步结果，再行术中快速免疫组化检测。

术中快速免疫组化染色也存在缺陷[6]：术中冷冻组织由于未经脱水、浸蜡等步骤，各组织成分软硬程度不一，影响切片完整度；切片过程中由于缓慢冻结或者冷冻时间过长等原因，易造成组织细胞内外冰晶及核内冰晶的产生，进而导致抗原弥散，影响阳性定位和后续判读；贴片后不能进行烤片，组织和玻片之间贴合仅靠温差作用和部分电荷作用，组织切片在后续15 min的持续浸泡、冲洗过程中也容易造成组织脱片、弥散等现象，在实验过程中需要克服以上难点。