丹顶鹤源东方次睾吸虫ITS序列分析

李 烨 ， 张 莹, ， 高忠燕 ， 张显光 ， 金振华 ， 王春仁 ， 史同瑞

(1.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院 ， 黑龙江 齐齐哈尔 161005 ； 2. 黑龙江八一农垦大学动物科技学院 ， 黑龙江 大庆 163319 ； 3. 扎龙国家级自然保护区管理局 ， 黑龙江 齐齐哈尔 161002)

丹顶鹤为世界级濒危保护动物，是我国的一级保护动物，野生数量不足2 500只，主要分布在我国的黑龙江省和东部沿海、朝鲜北部、俄罗斯东部、日本北部等地[1]。丹顶鹤主要食用鱼虾、昆虫、蛙类等，辅食多为嫩叶、鼠类等。丹顶鹤的饮食习惯导致其患有鱼源性寄生虫病的风险大大提高。次睾吸虫的第一中间宿主为纹沼螺，第二中间宿主主要为麦穗鱼，据调查2019年齐齐哈尔地区麦穗鱼感染东方次睾囊蚴的感染率达到32.59%[2]。东方次睾吸虫(Metorchisorientalis)的囊蚴寄生于鱼背部肌肉或皮层内，丹顶鹤多因食入携带囊蚴的麦穗鱼而感染。东方次睾吸虫主要寄生于家禽和野生禽类的胆管和胆囊，偶尔也可以感染犬猫和人，属于人兽共患寄生虫[3-5]。病禽通常出现消瘦贫血，食欲不佳和腹泻等症状，严重时可以导致死亡。死亡后剖检，可见胆囊壁增厚，胆囊肿大，胆汁变性，胆道堵塞等病理变化[6]。人体感染后，会出现腹胀腹痛，肝区不适等临床症状[7]。快速准确地鉴定寄生虫种类是对流行病学、疾病防控和病原研究等方面的前提。寄生虫鉴定的传统方法是基于形态学鉴定，目前分子生物技术已经广泛地应用于鉴定寄生虫种类。核糖体DNA基因(rDNA)内转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)的多态性序列分析(rDNA ITS序列分析)被认为是鉴定寄生虫虫种的良好基因标记，ITS序列可分为ITS1、5.8S rDNA和ITS2，特点是高度保守，进化速度快和种内差异小[8-10]。因此，本试验对我国黑龙江省齐齐哈尔扎龙地区分离的丹顶鹤东方次睾吸虫进行形态学观察与分子生物学鉴定，并与其他相关吸虫ITS序列进行了比较与进化分析，为丹顶鹤东方次睾吸虫的种系发生关系和鉴别诊断方法的建立提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 虫体 次睾吸虫采自黑龙江省齐齐哈尔市扎龙地区自然感染丹顶鹤的胆囊和胆管，经生理盐水冲洗干净后，于75%乙醇中保存备用。

1.2 主要试剂 基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]；TaKaRaExTaq酶、dNTPs、DL-2 000 Marker、pMD-18T载体[宝生物工程(大连)有限公司]；Axygen DNA凝胶回收试剂盒(康宁生命科学有限公司)；DH5α感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司)。

1.3 主要仪器 PCR仪(型号为Gene Amp PCR System 9700)，购自Thermo Fisher Scientific公司；电子显微镜(型号为 ECLIPSE E200)，购自NIKON公司；台式冷冻型微量离心机(型号为D3024R),购自美国塞洛捷克公司。

1.4 形态学观察 选取1条保存于75%乙醇中的吸虫，放置于载玻片上，盖上盖玻片，显微镜下进行观察并测量其大小，参照参考文献[11]鉴定虫体。

1.5 总DNA提取 取出5条保存于75%酒精中的东方次睾吸虫，分别用去离子水反复冲洗3次。根据TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)说明书提取DNA，提取完毕置于-20 ℃冰箱中保存。

1.6 ITS序列扩增 以DNA为模板，参照参考文献[12]中的NC5和NC2引物进行PCR扩增。PCR扩增体系(总体积为25 μL)：DNA 1 μL，dNTP 2 μL，10×ExTaqBuffer 2.5 μL，NC2和NC5各0.5 μL，ExTaq0.5 μL，ddH2O 18 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳，观察结果。参照凝胶回收试剂盒说明书对PCR扩增产物进行纯化回收后，pMD-18T载体连接PCR产物后转化到DH5α感受态细胞中进行培养，12 h后进行挑菌和菌液PCR鉴定，阳性菌液使用甘油保存，送至生工生物工程(上海)技术服务有限公司进行测序。

1.7 ITS序列的比较分析与进化分析 使用DNASTAR 5.0和MEGA 7.0软件对测序结果进行分析和划界。用Megalign软件对本试验中的东方次睾吸虫与其他后睾科吸虫的ITS序列进行同源性分析。使用Mega 7.0、Clustal X、Paup 4.0软件，将本试验的东方次睾吸虫的ITS2序列与相关吸虫序列进行比对，采用最大简约法(MP)，以日本血吸虫(Schistosomajaponicum，登录号：FJ852573)为外群构建进化树，确定本试验中的东方次睾吸虫在后睾科的系统发生位置。

2 结果

2.1 形态学观察 对压片虫体进行观察。如图1所示，虫体呈叶片形，体表有小棘，腹吸盘于体前的1/4处和口吸盘大小相近。咽呈球形，食道短，肠支一直延伸到虫体末端。睾丸呈分叶状，子宫回旋两肠支间，呈管状，含有大量虫卵。经测量，体长4.1 mm，体最宽处为1.1 mm。与参考文献[11]中东方次睾吸虫形态学一致。

图1 东方次睾吸虫形态(标尺=1 mm)Fig.1 Morphology of Metorchis orientalis(Bar=1 mm)

2.2 ITS序列扩增 本试验扩增的5条次睾吸虫的ITS序列(图2)，经测序后比对，获得5条序列一致的完整ITS序列。ITS序列全长为1 077 bp，其中ITS1、5.8S rDNA和ITS2的长度分别是629、160 bp和288 bp。ITS全序列的A+T含量为46.33%，G+C含量为53.67%，A、T、C、G 碱基的含量分别为17.46%、28.88%、28.23%、25.44%。ITS1序列的A+T含量为45.63%，G+C含量为54.37%，A、T、C、G 碱基的含量分别为17.49%、28.14%、27.34%、27.03%。5.8S rDNA序列A+T含量为45.62%，G+C含量为54.37%，A、T、C、G 碱基的含量分别为20.62%、25.00%、29.38%、25.00%。ITS2序列的A+T含量为48.62%，G+C含量为51.74%，A、T、C、G 碱基的含量分别为15.62%、32.64%、29.51%、22.22%。本试验获得的ITS序列与之前报道的东方次睾吸虫(MK482054)经过比对截齐后，二者的同源性达到99.8%。与黄体次睾吸虫(Metorchisxanthosomus)、胆囊次睾吸虫(Metorchisbilis)和Metorchisussuriensis(暂无中文名)的同源性分别为98.2%、97.6%和98.2%。

图2 东方次睾吸虫ITS序列扩增结果Fig.2 ITS sequence amplification results of Metorchis orientalisM: DL-2 000 Maker; 1～5:东方次睾吸虫ITS序列M: DL-2 000 Maker; 1-5:ITS sequences of Metorchis orientalis

2.3 系统发生树分析 基于ITS2序列构建后睾科吸虫系统发生树见图3，进化分析树自上而下形成3个大分支。片形科、棘口科、双腔科、并殖科、同盘科和背孔科吸虫形成了第1个大分支；后睾科吸虫形成了第2个大分支；前殖科吸虫形成了第3个大分支。在第2个大分支中，本试验的虫体与东方次睾吸虫聚集在1个小分支，表明本试验的次睾吸虫为东方次睾吸虫，此结果与传统的形态分类结果一致。本试验的虫体与其他次睾属吸虫聚集在1个分支，并与后睾属吸虫的分支形成了姐妹支，表明其亲缘关系较近。基于以上的形态学与分子生物学的结果，鉴定本试验中虫体为东方次睾吸虫。

图3 基于ITS2序列采取MP法构建后睾科系统发生树Fig.3 Phylogenetic tree of Opisthorchiidae by MP based on the ITS2 sequences▲：本试验虫体▲：The isolated worm from this experment

3 讨论

次睾吸虫病由次睾属吸虫引起，可以造成畜牧业严重的经济损失，也是全球的一个重要公共卫生问题[13-14]。目前，次睾属中已有26种被报道，其中8种寄生于哺乳动物，18种寄生于鸟类[13]。确定次睾吸虫的物种分类和进化大多基于成虫的形态[11]，基于形态学去鉴定并不能很准确定种，尤其在其他发育阶段的时候。rDNA序列具有高度保守性和进化时钟性，目前已被广泛地应用到物种进化和分类中，尤其是其中的ITS序列已经广泛用作种间的分类，解决了长期存在的寄生虫物种分类争议。李乔等[15](2020年)对野马体内线虫进行ITS序列扩增，通过结果鉴定其为马副蛔虫和鼻状杯环线虫。Na等[16](2016年)对东方次睾吸虫的线粒体基因组进行了扩增和进化分析，结果显示次睾属与后睾属形成了姐妹分支，与本试验的结果一致。通过本试验中的进化分析，东方次睾吸虫与其他次睾属吸虫处于1个小分支中，与传统的自然分类结果一致，综上说明ITS序列可以作为研究物种亲缘关系的基因标记。本试验对我国黑龙江省齐齐哈尔市扎龙地区丹顶鹤体内分离的次睾吸虫进行了分子生物学鉴定，确定丹顶鹤源的次睾吸虫为东方次睾吸虫，此结果为次睾吸虫的分子鉴别诊断和进化分析提供了科学依据。