不同感染阶段奶牛粪便副结核分枝杆菌的排逸状况分析

陈丰伟 ， 曹 杰 ， 马 翀 ， 张 巽

(1.海南农垦草畜产业集团有限公司 ， 海南 澄迈 571900 ； 2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193 ；3.中牧实业股份有限公司 ， 北京 丰台 100071)

奶牛副结核(Paratuberculosis),又称约内氏病(Johne′s disease,JD)，是一种慢性肉芽肿胃肠道疾病，其致病菌为副结核分支杆菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis，MAP)。JD牛可通过粪便以及牛奶传播MAP，易感牛只经口摄入后即可感染。Nielsen等关于JD牛不同感染阶段排放MAP情况的论述有[1]：一是JD牛在感染初期并不排菌，随着时间的延长会逐渐排菌；二是亚临床期虽不表现症状，但会向环境中间歇排菌；三是临床期表现腹泻症状后，会持续大量排菌。目前对于此病暂无有效的治疗，且无疫苗，因此JD牛持续大量排菌应当立即淘汰。

JD的防控应首先做好感染牛的标记与隔离，然而JD的检疫受到多种因素影响：一是感染早期牛主要以细胞免疫为主，降低了血清ELISA试验的敏感性[2]；二是亚临床期可能会通过粪便间歇性排放少量MAP，从粪便中分离和培养病原菌存在一定困难。世界动物卫生组织(OIE)于2014年颁布的相关文件提及JD检疫金标准仍然是粪便分离培养，这一检测方法工作量大，成本高，耗时长(需要花费大约16周的时间)[3]。如今，PCR基因检测技术正逐渐成为JD检疫的重要手段，该方法可快速得出结果，并具备与粪便分离培养相接近的特异性和敏感性[4]。

本试验选取北京地区某规模化奶牛场，收集MAP血清抗体阳性牛的粪样，提取DNA后，使用MAP Real-time PCR试剂盒进行检测，以期探明MAP血清抗体阳性牛的粪便排菌情况。

1 材料与方法

1.1 试验对象 试验牛场MAP血清抗体阳性率为11.13%。本试验在2015—2016年进行了3个批次的粪便采样和试验。对MAP血清抗体阳性牛进行粪便采集，并记录当时粪便性状、腹泻史情况。粪样分装于15 mL离心管，于-80 ℃冰箱冻存备检。

1.2 试验材料 粪便基因组DNA提取试剂盒，购自天根生物科技公司；MAP Real-time PCR试剂盒，购自Ingenasa公司。恒温水浴锅；干式加热板；无水乙醇；离心管；移液枪；滤芯枪头；MX-3005P实时荧光定量PCR仪，购自Stratagene公司；微量台式离心机和通用台式离心机，均购自Theromo Fisher公司。

1.3 试验方法 按照天根粪便基因组DNA提取试剂盒说明书进行粪样(180～220 mg)DNA提取操作，提取的DNA做好标记，于-20 ℃冻存备检。使用Ingenansa MAP Real-time PCR试剂盒进行DNA鉴定。

1.4 数据处理 分析MAP血清抗体阳性牛的粪便MAP检出情况，分析粪便性状(感染阶段)对粪便MAP检出率的影响。

2 结果

2.1 MAP血清抗体阳性牛粪便Real-time PCR结果分析 共检测189份MAP血清抗体阳性牛的粪便，MAP检出率达到5.82%(表1)，说明MAP血清抗体阳性牛可通过粪便排菌污染牛场环境，威胁易感牛群。36.51%样品结果无效，其原因可能是粪便中含有的植酸等物质干扰了PCR的酶反应。第3批次中有5个样品为复检样品，2次检测结果均为阴性或者无效。

表1 MAP血清抗体阳性牛粪便real-time PCR结果Tabel 1 Real-time PCR results of MAP-antibody seropositive dairy cattle

2.2 MAP血清抗体阳性牛粪便性状统计 异常的粪便意味着牛的消化系统存在损伤并伴随有腹泻症状，因此以粪便性状来确认牛有无腹泻表现。粪便性状异常，指的是水样粪、稀粪。

MAP血清抗体阳性牛的粪便性状异常率为11.11%(表2)，这一数值大于粪便MAP检出率(5.82%)。性状异常的粪便其MAP检出率为28.57%，而性状正常粪便的检出率仅为2.98%(表3)。上述结果证明，感染牛处于亚临床期或者临床期均可排菌，MAP血清抗体阳性牛临床期相比于亚临床期，排菌概率提高了25.59%。

表2 MAP血清抗体阳性牛粪便性状Tabel 2 Fecal character of MAP-antibody seropositive dairy cattle

表3 粪便性状与粪便real-time PCR结果对比分析Tabel 3 Relationship between real-time PCR results and fecal characters

2.3 粪便检出MAP的血清抗体阳性牛感染情况分析 粪便检出MAP的血清抗体阳性牛中，54.55%(6/11)粪便性状异常，45.45%(5/11)粪便性状正常，表明不能单纯通过粪便性状判定其中是否含有MAP(表4)，因为亚临床期MAP感染牛不表现症状，但仍可排菌[5]。有腹泻史的牛占90.91%(10/11)，表明向环境中排放MAP的血清抗体阳性牛大部分发生过腹泻或者正在腹泻。编号为K的牛处于MAP感染的亚临床期，无腹泻史记录，但已经通过粪便向环境中排放MAP。血清抗体阳性牛粪便Real-time PCR检测阳性的占72.73%(8/11)。结合MAP感染引起机体体液免疫应答的特点，推测较晚检出MAP血清抗体阳性牛的感染时间更靠后，即随着时间的延长，感染牛粪便排菌的概率会逐渐升高。

表4 粪便检出MAP的血清抗体阳性牛的real-time PCR具体结果Tabel 4 MAP real-time PCR results of MAP-antibody seropositive cattle

Real-time PCR技术可通过设定数个已知浓度的阳性对照，用于精确定量样品中目标基因起始拷贝数(Copies)的浓度。拷贝数是指每克粪便样品中所含有的MAP目的基因起始拷贝数，根据阳性梯度稀释对照所得标准曲线方程计算后再换算获得。第2批次的Real-time PCR试验由于引物不足，阳性梯度稀释对照无效，因此无法精确定量第2批次阳性样品的起始拷贝数。

试验结果显示，排菌阳性牛的每克粪便的MAP目的基因起始拷贝数为5.12×104～3.88×108。其中每克性状异常粪便平均含MAP目的基因起始拷贝数为1.49×108，正常粪便的则是4.67×106，由此可知MAP血清抗体阳性牛临床期的排菌量是亚临床期的32倍。

3 讨论

目前国际上使用Real-time PCR试验进行MAP相关研究已成为趋势[6]。Real-time PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。相较常规PCR，Real-time PCR具有更高的特异性和灵敏性，同时还能做到精确定量检测。Ingenasa公司的MAP Real-timePCR试剂盒是可用于进行含MAP DNA样品的定性和定量的检测。该试剂盒中的引物针对MAP特有的F57基因片段进行扩增，与引物匹配的TaqMan探针的荧光基团为FAM-BHQ1®。另外，该试剂盒还在MIX中添加了2种荧光基团，分别为JOE-BHQ1®和ROX，目的是排除假阴性以及可能被量化的计算错误。使用试剂盒中提供的标准阳性对照，并按照一定梯度稀释，可以绘制lg(Copies)—循环阈值(Ct)标准曲线，进而计算出样品中的起始拷贝数。

此次试验共检测189个粪样，结果显示Real-time PCR的粪便检出率为5.82%，证明了MAP血清抗体阳性牛的粪便中可以检出MAP，也说明了MAP血清抗体阳性牛不一定排菌。MAP血清抗体阳性牛粪便PCR结果的阴性率为57.14%。其原因可能是这些牛的病程尚未到排菌阶段，也可能已经进入亚临床期，但是呈现间断性排菌，或当时排菌量低于检测范围。试验中仅1头牛粪便PCR结果为可疑，其原因可能是该样品中MAP含量处于可疑范围，应结合试剂盒说明书要求，重新采集血清抗体阳性牛的粪样进行DNA提取操作。而对于结果无效的样品，其无效的原因可能是因为样品中含有的多糖、植酸干扰了PCR试验。研究人员正在探索如何通过改良粪便DNA提取操作来提升MAP Real-time PCR试验的敏感性[7]。例如由Adiavet公司生产的新型粪便提取试剂盒,借助于新技术Adiafilter，可以将检测粪样重量提高到3～10 g，使单个样品检测量增加并且更具代表性，从而提高Real-time PCR试验的敏感性，同时还能保证PCR的酶反应免受粪便中其他物质的抑制[8]。

MAP血清抗体阳性牛相比于亚临床期，临床期向环境中排放MAP的概率提高了25.59%，且临床期牛MAP排放量为亚临床期牛MAP排放量的32倍。虽然处于亚临床期的无腹泻表现牛也可能排菌，但是考虑淘汰成本，建议对无腹泻表现牛采取隔离措施，待其表现症状再淘汰。

本试验通过病史调查发现，90.91%的MAP排菌牛有腹泻史。尽管这些排菌牛的MAP排放量存在差异，但是均对奶牛的生活环境构成了污染，威胁牛群健康。综上所述，牛场应对MAP血清抗体阳性牛进行标记和隔离，一旦出现腹泻症状应立即淘汰。