应用RNA-Seq技术筛选低钙环境下牛肾细胞差异表达基因

朱雨凝 ， 姜忠玲 ， 丛 霞 ， 曹荣峰 ， 李华涛 ， 田文儒 ， 丰艳妮

(青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109)

奶牛钙、磷代谢紊乱性疾病是奶牛养殖业中重要常发病，围产期奶牛分娩后转为泌乳过程的生理应激，以及体内钙的分配供给失衡，无法维持正常的血钙浓度，易发生低钙血症[1]；正常泌乳奶牛受疾病、饲养或环境等因素影响机体钙代谢平衡，也会引起奶牛钙代谢紊乱。钙的代谢与肾脏功能密切相关，肾小球滤出的钙90%以上被肾小管重吸收，肾脏相关疾病会引起钙代谢紊乱，同样钙代谢紊乱也会引起肾脏疾病[2-3]。

RNA-seq作为一种高通量测序技术，能在单核苷酸水平上对特定器官、组织或细胞所处状态的转录活动进行深度检测[4]。现有的诊断方法难以对奶牛钙磷代谢紊乱性疾病进行早期诊断或预警。因此，本试验以牛肾小管上皮细胞为研究材料，利用RNA-seq技术分析低钙环境造成差异表达基因，以期找出低钙状态下早期诊断或预警围产期奶牛低钙血症的方法或生物标志物，为有效预警围产期奶牛低钙血症并提早防控其发生、发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 高糖DMEM/F12，购自美国Gibco公司；胎牛血清(FBS)，购自HyClone公司；EDTA、EGTA、100×青链霉素混合液、核酸染料、琼脂糖粉剂和1×TAE电泳液，均购自北京索莱宝科技有限公司；二甲基亚枫(DMSO)、胰蛋白酶，均购自美国默克密理博公司；CCK-8试剂和Ca2+浓度测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；TRIzol溶液、cDNA反转录试剂盒、荧光染料(TB Green PremixExTaqⅡ)和DL2 000 Marker，均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix，购自北京全式金生物；Qubit®RNA检测试剂盒，购自Life Technologies(美国)；引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成；其他试剂均为化学分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 牛肾细胞MDBK(NBL-1)，购自中国科学院，源自美国ATCC细胞库。用含10%胎牛血清和1%青链霉素的高糖F12/DMEM完全培养液将牛肾细胞培养于直径60 mm的培养皿中，调整细胞数量约为106个，置于37 ℃含5%CO2的饱和湿度培养箱中培养。

1.2.2 牛肾细胞体外低钙培养环境的建立 依据参考文献[5]，利用EGTA螯合Ca2+来创造低钙环境，将牛肾细胞分为DP组(对照组，Ca2+浓度为0.959 mmol/L)、DE1组(0.5 mmol/L EGTA，Ca2+浓度为0.851 mmol/L)、DE2组(1.0 mmol/L EGTA，Ca2+浓度为0.429 mmol/L)和DE3组(2.0 mmol/L EGTA，Ca2+浓度为0.002 mmol/L)。利用CCK-8试剂盒连续测定每天的细胞活力并绘制细胞活力曲线。同时，在显微镜下观察更换培养液后1～3 d细胞的形态变化，以确定下一步试验的Ca2+浓度和处理时间。

1.2.3 cDNA文库构建 试验组和对照组细胞培养72 h送公司进行测序，简要步骤如下：提取细胞总RNA，将富集mRNA打成短片段，以其为模板，合成cDNA第1链和第2链。将双链cDNA纯化修复后加polyA尾，连接测序接头，选择适宜片段进行PCR扩增及其产物纯化，最终得到特异性cDNA文库，质检合格后上机测序。

1.2.4 RNA-seq测序数据分析 参考文献[6]方法进行测序分析系，即将Clean reads与参考基因组序列比对，统计检验获得差异表达基因，最后对差异表达基因进行功能注释及GO、KEGG富集检验，获得差异表达基因所富集的GO、KEGG集合。

1.2.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检验测序结果 依据测序结果挑选与Ca2+浓度密切相关的差异基因运用RT-qPCR验证，引物序列如表1。PCR程序：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，40个循环。β-actin为内参基因，以2-△△Ct方法计算mRNA相对表达量。使用GraphPad Prism 6.0软件中One-way ANOVA进行分析，P<0.05时有统计学意义。

表1 实时荧光定量PCR引物Table 1 Real-time qPCR primers

2 结果

2.1 钙离子浓度与细胞生长 与DP组相比，DE1组和DE2组细胞活力在培养第2天后开始下降，而DE3组细胞活力从第1天开始一直呈下降趋势，第3天细胞活力基本为0。DE2组细胞生长活力在第3天开始出现明显的下降，到第4天达到最低。DE1组细胞活力变化则不明显(图1)。

图1 不同钙浓度培养基中牛肾细胞细胞活力Fig. 1 Viability of bovine renal tubular epithelial cells in media containing different calcium concentrations

观察不同浓度Ca2+培养基处理的细胞形态，如图2所示，DE3组从24 h开始出现细胞脱壁现象；与DP组相比，DE1组细胞变化不明显，而DE2组细胞表现为增殖速度减慢，细胞漂浮较多，因此，选择DE2组(1mmol/L EGTA)作为试验组进行测序以分析差异基因的表达。

图2 不同Ca2+浓度培养液培养的牛肾小管上皮细胞生长状态(40×)Fig.2 Growth status of bovine renal tubular epithelial cells cultured in the media containing different calcium concentrations (40×)黑色箭头:细胞皱缩； 白色圆圈:细胞质空泡化Black arrow:Cell shrinkage； White cycle:Cytoplasmic vacuolation

2.2 测序质量评估 为保证信息分析质量，对原始测序序列(Sequenced reads)进行过滤后得到Clean reads，基于Clean reads进行后续分析。检测发现，GC含量为47%左右，Q20值达100%，Q30值在99%左右，碱基质量符合要求。

2.3 差异表达基因的筛选 以log2(Fold change)和显著水平(q-value)2个因素进行评估，并用火山图可视化差异表达基因的整体分布情况。本试验中共发现差异表达基因114个，其中上调基因21个，下调基因87个(图3)。

图3 试验组与对照组间基因差异表达分析火山图Fig.3 Comparative analysis of differentially expressed genes between the experimental group and the control group蓝点：下调的差异表达基因；红点：上调差异表达基因；灰点：非差异表达基因Blue dots: Down-regulated genes; Red dots: Up-regulated genes; Gray dots: Non-differentially expressed genes

2.4 差异表达基因GO富集分析 GO分析包括细胞组成、分子功能和生物过程3个方面。本试验中差异表达基因主要富集在蛋白质合成(超过20个)、磷脂酰肌醇调节信号通路(4个)、PI3K-Akt信号通路(3个)、肌醇介导的信号通路(4个)等通路中(图4)。

图4 两组细胞差异表达基因GO富集分析柱状图(DE组与DP组比较)Fig.4 Histogram of GO enrichment analysis of differentially expressed genes in two cell groups(DE group versus DP group)

2.5 差异表达基因KEGG富集分析 本试验发现，差异表达基因中PIK3CA、G-CSF、TSC2、CDC37、ERBB3和MDM2等富集于PI3K-Akt信号通路中(图5A)；PLCD3、PIK3CA、TSC2和MDM2等富集于甲状腺激素信号通路中(图5B)，这些差异基因的富集对生物标志物的寻找有重要的提示作用。

图5 信号通路的变化 Fig.5 Changes of the signal pathwaysA：PI3K-Akt; B:甲状腺激素信号通路深色阴影标注：表达量减少的基因； 浅色阴影：表达量增加的基因A:PI3K-Akt; B:Thyroid hormone signal pathwayDark shading marks: Genes with reduced expression; Light shadows: Genes with increased expression

2.6 RT-qPCR验证差异基因 结合Ca2+调节的特点，选取与Ca2+密切相关的14个差异显著基因，采用RT-qPCR技术验证其表达量。基因的差异表达倍数(log2FC)与测序结果进行比较。结果显示，筛选的14个基因的变化趋势与转录组测序结果基本相同(图6)。

图6 RT-qPCR与RNA-seq测序结果差异倍数及趋势对比Fig.6 Comparison of differential multiple and trend between RT-qPCR and RNA-seq results

3 讨论

奶牛低钙血症不仅是围产期的代谢类疾病，还会诱发奶牛其他产后期疾病，严重影响奶牛的健康和经济效益。钙的代谢与肾脏关系密切[2,7]。生理情况下，循环中的钙平衡，尤其是游离钙的平衡常常依赖于肾脏的调节。本试验基于Illumina HiSeq Xten测序平台对低Ca2+环境下的牛肾细胞进行转录组测序，寻找低钙环境下差异表达的基因，借助GO和KEGG富集分析，为找出潜在的评估奶牛低血钙的生物学指标奠定基础。

本试验中，富集在甲状腺信号通路里的差异显著基因主要有MDM2、PLCD1、P1K3CA、TSC2。MDM2作为一种原癌基因，是调节p53通路的重要基因，具有降解p53及泛素化的功能，能够增强细胞生存活力，延长细胞生存期，促进细胞生长[8-9]。PLCD1是PLC超家族的成员之一，PKC信号转导途径中的一个关键酶，其C2结构域可以结合2个Ca2+，通过引导Ca2+释放和活化蛋白激酶C参与细胞代谢的调节，在细胞内信号传导、激素分泌、钙稳态、膜转运以及细胞骨架整合等过程中发挥重要作用[10-11]。PIK3CA基因是磷脂酰肌醇-3激酶催化亚基α基因，其蛋白是PI3K-Akt信号通路中的重要因子，参与细胞增殖、黏附和分化以及细胞支架结构重排等生理过程[12-13]。作为肿瘤抑制因子，TSC2基因的蛋白产物Tuberin，通过抑制mTOR的活性，控制细胞的增殖与分化。在有丝分裂期间，PI3K/Akt磷酸化Tuberin，降低其GAP活性，抑制Hamartin/Tuherin复合体的抑肿瘤功能[14]。本试验中，PLCD1、PIK3CA、TSC2在低钙环境下的表达量均呈下降趋势，仅MDM2呈上升趋势，说明低钙环境均对细胞的增殖、黏附、分化以及细胞支架结构和细胞抑癌功能都具有负面的影响。

PI3K/Akt信号通路是生物体内重要的信号转导系统之一，可调节多种生理功能，对细胞凋亡、恶变、肿瘤、放射治疗、病理性疼痛等都有重要作用[13,15]。在本试验中，TSC2、MDM2、PIK3CA与G-CSF、CDC37和ERBB3等基因富集在PIK3-Akt信号通路中。G-CSF在体内来源广泛，能刺激位于休止期多能造血干细胞进入细胞周期，增加中性粒细胞的数量，激活其杀菌活性，从而有效地刺激骨髓造血，动员造血干细胞进入外周血[16-17]。CDC37特异地募集蛋白激酶与HSP90结合形成分子伴侣复合体，以维持激酶蛋白的稳定和正常功能[18]。研究表明，Akt蛋白与CDC37和HSP90形成分子伴侣复合体后，能够被其上游激酶PDK1所激活；此外，外源性Cdc37也可以增强Akt和Hsp90之间的结合[19]。ERBB3又称为HER3基因，是表皮生长因子受体家族(EGFR)中的第3个成员，它与ERBB2形成的异源二聚体通过激活PI3K-Akt/NF-κB抗凋亡级联反应，使肿瘤细胞能抵抗凋亡[20]。在本试验中，除MDM2以外，其他基因的表达量在低钙环境下都是下降的，由此可见，低钙环境不利于细胞免疫功能、抗凋亡能力、细胞内信号转导等功能的发挥。

Ca2+对细胞连接构成以及维持发挥重要的作用，细胞外游离Ca2+浓度降低或细胞内游离Ca2+浓度升高均可抑制细胞间隙连接，破坏其完整性[21-22]。因此，我们认为钙的吸收和调节对维持细胞正常功能至关重要。甲状腺激素可以调节肾小管对钙的重吸收，调节尿液中的钙含量，以维持机体钙平衡；此外，甲状腺激素影响骨重建、促进破骨细胞生成，调节骨骼的新陈代谢，对骨骼生长、结构和强度维持起关键作用[23]。低钙环境下，肾小管上皮细胞差异表达的基因有些富集在甲状腺激素信号通路和PI3K-Akt信号通路中。因此，我们认为低钙对细胞的影响可能是通过甲状腺激素信号通路来起作用的。

低钙环境可抑制牛肾细胞的增殖、分化、抗凋亡和细胞支架结构，本试验从114个差异表达基因中筛选出与Ca2+调节相关的14个基因并验证，为进一步利用患病牛建立奶牛低钙血症诊断的生物学标志提供了试验基础和依据。