牛乳源肽Lfcin B 抗菌活性、稳定性及协同效应研究

2021-03-16刘又铭宋倩倩管庆丰张海文

饲料工业 2021年3期

刘又铭房鑫陈璐宋倩倩管庆丰张海文*

(1.海南大学动物科技学院，海南海口570228；2.海南大学生命科学与药学院，海南海口570228）

关于抗生素耐药性的发展已经引起了食品和发酵行业的高度关注和警惕[1]。病原菌的耐药性提高会造成更高的死亡率和财产损失，目前抗生素已被纳入动物饲料的亚致死浓度，旨在防止几种食源性病原菌耐药性增加[2]。在过去的几年里，大量研究都投入到鉴定新型抗生素之中[3]。抗菌肽作为一种机体在外界刺激诱导下，由特定基因编码与合成的一类普遍存在的具有广谱抗菌活性的寡肽，因为有多种作用机制共同作用，使得微生物很难获得耐药性[4]，迅速吸引注意力作为发展新型治疗药物的候选药物[5]。牛乳铁蛋白（Lactoferrin Bovine，LFB）被称作“奶黄金”，大量存在于牛的初乳中，分子量约为80 kDa[6]。LFB 具有多种生物活性，如广谱抗菌性、抗癌性及免疫调节性[7]。牛乳源肽（Lfcin B）由LFB 在酸性条件下经胃蛋白酶水解后，从N 端释放的由25 个氨基酸残基组成的一种阳离子抗菌肽[8]。Lfcin B 的氨基酸序列为FK⁃CRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，结构中的两个半胱氨酸通过形成分子内二硫键使Lfcin B 呈现不完全的桶状结构[9]。Lfcin B作为LFB消化分解后的活性短肽除了不能转运铁离子外，拥有LFB大部分的生物学功能，其体外抗菌性还比LFB 强400 倍[10]。本试验通过研究Lfcin B 对几种畜禽常见病原菌的抗菌活性，并以此为基础来探究Lfcin B 与几种常见饲用抗生素的配伍效果以及Lfcin B 在体外不同条件下的稳定性。探讨其替代饲用抗生素的可能性，为Lfcin B 在畜禽生产中的实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

受试菌株均来自中国普通微生物菌种保藏管理中心，革兰氏阴性菌：大肠杆菌ATCC 25922、猪霍乱沙门氏菌CMCC 50020；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌ATCC 25923。

1.2 主要试剂

牛乳源肽Lfcin B，购自吉尔生化有限公司，纯度≥95%；阿莫西林，购自江西省科达动物药业有限公司，生产批号：20170713；庆大霉素，购自德润通生物，生产批号：170301；土霉素，购自山西兆益生物有限公司，生产批号：171001。

1.3 菌悬液的准备

解冻冷冻保存于-80 ℃的菌株，使用接种环将菌株在MH琼脂平板上划线接种，置于37 ℃条件下培养18～24 h；挑取琼脂平板上的单菌落接种于3 mL新鲜MH液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床中以250 r∕min的转速过夜培养；待菌液浑浊后取30 mL浑浊菌悬液转接到3 mL 新鲜MH 液体培养基中，于37 ℃恒温摇床中以250 r∕min 的转速培养2～5 h，直至分光光度计测定OD600=0.5～0.6，菌悬液即可作为试验用菌液。

1.4 最小抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC)的测定

实验方法参考本实验室前期文章[11]，取出冷冻保存的Lfcin B，于96 孔板上梯度稀释为2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10 μg∕mL 的Lfcin B 抗菌肽稀释液；阿莫西林的浓度配制为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 μg∕mL；土霉素浓度配置为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 μg∕mL；庆大霉素浓度配制为20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078 μg∕mL。然后在无菌96 孔板中依次加入上述菌悬液90 μL，另设两孔作为空白对照，一孔加入100 μL 菌悬液作为阳性对照；另一孔加入100 μL MH液体培养基作为阴性对照。将96孔板盖好盖子置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h；观察96孔板底部是否有细菌沉淀产生，无肉眼可见细菌沉淀的孔中对应的最小浓度即为Lfcin B以及各抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。再以无肉眼可见细菌沉淀的孔为基点，取更高测试药物浓度的孔中菌液10 μL稀释一定浓度后涂布于MH平板（包括MIC值所在的孔），置于37 ℃恒温培养箱中倒置培养18～24 h，以平板上不长任何菌落所对应的药物浓度为MBC值，每个菌种设置6个重复。

1.5 Lfcin B与抗生素的协同杀菌效应

以Lfcin B抗菌肽与阿莫西林联合作用为例：分别配制终浓度为2、1、1∕2、1∕4、1∕8、1∕16倍MIC的Lfcin B和阿莫西林。根据6×6棋盘法实验，将Lfcin B纵向添加，阿莫西林横向添加；在96孔板中各滴加5 μL不同浓度的抗菌物质，同时加入90 μL菌悬液。使得每一纵列孔中LfcinB的终浓度依次为2、1、1∕2、1∕4、1∕8、1∕16倍MIC，同时每一纵列孔中阿莫西林浓度不变；每一横行孔中阿莫西林的浓度依次为2、1、1∕2、1∕4、1∕8、1∕16 倍MIC，同时每一横行孔中Lfcin B 的浓度不变。混合均匀后于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。每个试验做3 次独立重复。根据部分抑菌浓度指数判断联合药敏实验的效果：

FIC指数=MIC1∕MIC2+MIC3∕MIC4

式中：MIC1——甲药联合使用时的MIC；

MIC2——甲药单独使用时的MIC；

MIC3——乙药联合使用时的MIC；

MIC4——乙药单独使用时的MIC。

根据以下FIC指数值的范围即可判断LFcin B与不同抗生素联合用药的效果。协同效应：FIC 指数≤0.5；相加作用（部分协同）：0.5＜FIC 指数≤1；无关作用：1＜FIC指数≤2；拮抗作用：FIC指数＞2。

1.6 Lfcin B稳定性的测试

将4 ℃保存的Lfcin B 母液在40、50、60、70、80、90 ℃水浴加热15 min，按照1.4 中的步骤测定不同温度处理过的Lfcin B的MIC。配制pH 为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的PBS 缓冲液，同时梯度稀释Lfcin B 母液，将稀释液和PBS 缓冲液按照1∶1比例混合，设不加抗菌肽的PBS缓冲液为对照组，按照1.4中的步骤测定MIC。

2 结果

2.1 Lfcin B和不同抗生素对病原菌MIC和MBC的测定

Lfcin B和不同抗生素对病原菌MIC和MBC的测定结果如表1 所示。由表1 所示，在相同的实验条件下，Lfcin B 和抗生素均有抑菌和杀菌的效果。其中，阿莫西林的效果最强，对所测病原菌的MIC 均小于0.1 μg∕mL；庆大霉素和土霉素对所测病原菌的生长均有较强的抑制作用；Lfcin B对所测致病菌的抑菌活性较弱于常见的抗生素，对所测病原菌的MIC大致相等，说明其可能具有广谱抗菌活性。

表1 Lfcin B和抗生素对几种常见致病菌MIC、MBC测定结果

2.2 Lfcin B和抗生素联合使用对几种常见致病菌杀菌效应

Lfcin B分别与土霉素、庆大霉素和阿莫西林对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和猪霍乱沙门氏菌的协同杀菌效应实验结果如表2所示，在土霉素与Lfcin B联合使用对金黄色葡萄球菌杀菌作用的检测中，联合用药并没有使土霉素的用量降低，除此之外，其他实验都表现出联合用药可以降低药品添加量。将表2 的数据带入FIC指数计算公式中（参见材料与方法1.5），得出FIC指数如表3所示。Lfcin B与三种常用抗生素联合使用的FIC 指数最低为0.312 5，表现为协同作用，最高为1.5，表现为无关作用。其中，Lfcin B和阿莫西林联合作用的协同效应最强，联合杀菌效果为协同作用，二者的相互促进作用最为明显。Lfcin B和庆大霉素联合作用的协同效应其次，联合杀菌效果为部分协同作用。Lfcin B和土霉素联合作用的协同效应最差，对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌表现为无关作用。同时数据显示，Lfcin B与一种抗生素的协同作用对革兰氏阴性菌的FIC指数要低于革兰氏阳性菌的。

表2 Lfcin B和抗生素对几种常见致病菌的协同杀菌效应

表3 Lfcin B和抗生素对几种常见致病菌的FIC指数

2.3 Lfcin B体外稳定性的测定

选取三种病原菌进行Lfcin B 体外稳定性的测定，结果如表4 所示。表4 结果表明，温度和pH 的变化会对Lfcin B 的稳定性产生影响。温度在40～60 ℃的条件下抗菌活性没有变化，当温度升至90 ℃时，MIC 值提高到了8 倍，依旧具备抗菌活性，可见Lfcin B热稳定性良好。在pH为3的酸性条件下Lfcin B在选定浓度范围内无法抑制细菌的生长，所以酸性环境对Lfcin B 的活性影响相对较大。在碱性条件下，Lfcin B的抗菌活性相对稳定，表明Lfcin B对碱性条件的耐受力要强于其对酸性条件下的耐受力。

3 讨论

有报道称从牛乳铁蛋白中提取的有抗菌活性的肽，这种活性来自Lfcin B 中的RRWQWR 基序，这被认为是已知的最小的抗菌基序[12]。Lfcin B 具有广谱的抗菌活性，但对于不同的菌类具有不同程度的抗菌效果，有研究认为Lfcin B17-31肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌作用是通过不同的机制进行的[13]；有研究称是因为细菌结构，革兰氏阳性细菌只有一层膜（包围细胞的细胞质膜），而革兰氏阴性细菌有两层膜（细胞质膜和外膜）导致的抗菌效果差异[14]；还有研究称这主要是因为某些细菌细胞膜表面存在一种可以抵抗乳铁蛋白杀伤力的蛋白受体-乳铁蛋白结合蛋白B[15]。根据Sun 等[16]的研究,牛乳铁蛋白肽Lfcin B18-28作为牛乳铁蛋白肽的截短肽对于大肠杆菌的MIC 值为16 μmol∕L，而对金黄色葡萄球菌没有展现出抗菌作用。在本次试验中，Lfcin B对三种病原菌均表现出抗菌活性，其中对金黄色葡萄球菌抗菌效果最好。在张云威[17]的试验中，其用化学合成的牛乳铁蛋白肽对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的MIC 值均为24 μg∕mL。而Ptaszyńska等[18]的研究指出，Lfcin B对于金黄色葡萄球菌与大肠杆菌具备较强的抑菌效果，这与本次实验结果一致。根据刘倚帆等的研究[19]，猪源乳铁蛋白LfcinP-20对大肠杆菌的MIC值为32 μg∕mL，对金黄色葡萄球菌的MIC值为128 μg∕mL。根据蔡屾等[20]的研究，利用基因工程技术在大肠杆菌中表达的人乳铁蛋白肽对大肠杆菌的MIC 值为80 μg∕mL。本次实验所选择的牛乳源肽Lfcin B 抗菌效果明显优于以上报道的其他来源的乳铁蛋白肽。

表4 Lfcin B在不同条件下的稳定性分析

有研究认为，与外细胞膜的相互作用导致内膜完整性的丧失，并促进其他抗菌药物的吸收，如抗生素和其他抗菌肽，这就是Lfcin 多肽与常规抗生素协同作用[21]。本次试验中Lfcin B与三种抗生素联合使用，其中与阿莫西林联合使用效果最好，均为协同效应，此结果与本实验室前期对抗菌肽PR-39 的研究一致[11]，但其FIC值要略低于本次实验，对大肠杆菌的FIC 指数为0.16，对金黄色葡萄球菌的FIC 指数为0.28，表明这次所试Lfcin B与阿莫西林配伍效果略低于PR-39。在众多抗菌肽与抗生素联合使用的研究中，也存在如猪源抗菌肽与某种抗生素联合使用效果为无关作用的情况[22]。在本次试验中Lfcin B 与土霉素联合使用对金黄色葡萄球菌表现为无关作用，而同样是Lfcin B 与四环素抗生素中最强的二甲胺四环素联合使用，被报道可明显增强对金黄色葡萄球菌的抗菌活性[23]，这说明同属四环素类抗生素的杀菌机制可能存在一些差异。有趣的是，本次试验中Lfcin B 与庆大霉素联合使用表现为部分协同，而有报道称Lfcin B 与庆大霉素之间无协同作用[24]。庆大霉素属于氨基糖苷类抗生素，根据Vorland 等[25]的研究，氨基糖苷类抗生素可以通过竞争性地取代细胞膜上的Mg2+、Ca2+，在细胞膜上形成孔道，破坏膜的渗透性，导致细胞膜屏障被破坏，这种对细胞膜的作用机制，可能会竞争性地抢夺Lfcin B 与细胞膜结合的靶位点，从而导致其不能有效地发挥抗菌作用[26]。本研究中乳铁蛋白肽Lfcin B 与庆大霉素表现出部分协同效应，推测是由于在该庆大霉素试验浓度下，未对细胞膜上的阳离子形成较大的竞争性取代效果。

抗菌肽应用于生产，会受到多种不稳定因素的影响，例如高温环境，人和动物口腔、胃、肠道内的pH 环境等[27]。本次试验中，温度在40～60 ℃的条件下抗菌活性没有变化，对酸碱环境有一定的耐受力，对碱性条件的耐受力要强于其对酸性条件下的耐受力。抗菌活性随着温度的变化规律符合吴琼英等[28]报道，在60 ℃以上时，乳源抗菌肽的活性随温度升高而降低。Lfcin B 的热稳定性良好，王海梅等[29]的研究在Lfcin B 的基础上改良蛋白结构，设计出的新型抗菌肽KW-WK和LFcin B18-28经过100 ℃处理1 h，MIC 仍为4 μmol∕L 和16 μmol∕L。任娇[30]发现酸性环境会显著降低山羊乳酪蛋白抗菌肽的抑菌活性，pH为3 时，抗菌肽甚至出现严重絮凝现象，这也符合本次试验中pH 为3 时，在测试的浓度范围内未检测出最小抑菌浓度。