HPLC法测定复方参龙胶囊中5个功效成分的含量

高亚亚,柴旭兵,闫 俊,叶 楠,曹团平,杨 莹,封 婷

(1西安市第五医院神经内科,西安 710082;2榆林市第一医院神经内科;*通讯作者,E-mail:fengting1126@126.com)

脑梗死是一种临床中常见的脑血管疾病,主要是由于脑血管血栓形成导致脑组织供血供氧不足引起的[1],具有高致残率、高致死率的特点。一般临床中将其分三种类型即脑血栓、腔隙性梗死、脑栓塞,该疾病由于起病急、发展快,在短时间内可造成脑组织坏死或软化,其预后较差,存在偏瘫、失语等多种并发症[2-4]。目前由于人们生活方式变化,不注重饮食习惯,其发病率越来越高,发病率约占血管性痴呆总发病率的8%-12%[5-7]。在临床治疗上,采用常规治疗方式尽管在早期能够实现溶栓,减少神经功能损伤,但临床中所收治的患者多数错过了溶栓时间窗,再进行常规治疗的效果不甚理想。所以亟需寻找理想治疗方法,中药为我国传统医药,能通过多环节、多途径、多靶点对疾病进行全面治疗[8]。复方参龙胶囊为本院临床运用多年的院内制剂,由西洋参、三七、黄芪、远志、当归等组成,治疗脑梗死临床疗效反应良好。因此,笔者采用高效液相色谱法检测该制剂主要功效成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd,为该制剂建立质量控制方法,亦为该制剂的动物药代动力学和组织分布研究奠定了基础;同时功效成分的检出与定量亦为临床运用提供科学依据。

1 仪器与试药

岛津高效液相色谱仪(Prominence LC-2030,带自动进样器,LC/Labsoluion色谱工作站),日本岛津公司;Shim-pack VP-ODS液相色谱柱:Intersil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,岛津技迩上海商贸有限公司经);ME235S型电子分析天平,德国塞多利斯公司;KQ-5200DE型数控超声波发生器,昆山超声仪器有限公司。对照品:三七皂苷R1(批号:110745-201921,含量90.4%)、人参皂苷Rg1(批号:110703-201933,含量93.4%)、人参皂苷Re(批号:110754-202028,含量以93.9%)、人参皂苷Rb1(批号:110704-202028,含量93.1%),人参皂苷Rd(批号:111818-201603,含量92.1%),均购自中国药品食品检定研究院;复方参龙胶囊(批号170108、170109、170110,规格0.4 g/粒)为西安市第五医院药剂科制备;超纯水(由美国密理博纯水仪制备,美国密理博公司);乙腈、甲醇均为HPLC级,美国Fisher公司;其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液溶液(B),梯度洗脱见表1。记录时间为100 min。体积流量:1.0 ml/min;柱温:30 ℃;检测波长:203 nm;进样量:10 μl;理论板数按人参皂昔Rb1峰计算应不低于4 000[9]。

表1 梯度洗脱表

2.2 混合对照品溶液的配制

分别精密称取三七皂苷R1 5.00 mg、人参皂苷Rg1 8.00 mg、人参皂苷Re 7.00 mg、人参皂苷Rb1 10.00 mg,人参皂苷Rd 6.50 mg置于10 ml量瓶中,加甲醇定溶至刻度,摇匀,即得混合对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取20粒本品,倾出内容物,研细,混匀,称取粉末5 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入50 ml甲醇,称定重量,放置过夜,超声处理(功率250 W,频50 kHz)30 min,放凉,用甲醇补足减失的重量,摇匀,静置,再用0.45 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.4 阴性对照溶液的制备

按处方比例,分别制备缺西洋参和三七模拟制剂,再分别按“2.2.3”项制备阴性对照溶液。

2.5 标准曲线及线性范围

分别精密量取混合对照品0.05,0.10,0.20,0.04,0.80,1.00 ml,分别置于各个1 ml的量瓶中,加甲醇定容至1 ml,分别得混对照品溶液1,2,3,4,5,6。进样测定,记录峰面积,考察对照品浓度(x)与峰面积(y)的线性关系,结果各种成分在相应的浓度范围内具有良好的线性关系(见表2)。

表2 对照品的线性方程及其浓度范围

2.6 专属性实验

按2.1项色谱条件分别进样阴性对照溶液、供试品溶液、混合对照溶液,结果阴性对照均无干扰,见图1。

1.三七皂苷R1;2.人参皂苷Rg1;3.人参皂苷Re;4.人参皂苷Rb1;5.人参皂苷Rd

2.7 精密度实验

取混合对照品溶液4,连续测定6次,进样测定峰面积,计算RSD值。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的RSD分别为0.82%,0.95%,0.89%,1.04%和1.01%,说明仪器精密度良好。

2.8 稳定性实验

使用混合对照品溶液4,分别于0,2,4,8,12,24 h,进样测定峰面积,计算RSD值。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的RSD值分别为1.03%,0.96%,0.97%,1.21%和1.12%,说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.9 重复性实验

称取样品(批号170108)5 g,精密称定,按上述2.3项供试品制备方法制备6份供试品溶液及按2.1项色谱条件测定。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的RSD值分别见表3,结果显示仪器重复性良好。

表3 重复性测定结果

2.10 加样回收率

称取样品(批号170108)5 g,精密称定,精密称定6份,分别按表4添加对照品溶液,依据上述2.3项供试品制备方法与2.1项色谱条件测定。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的平均回收率和RSD值见表4,结果显示本方法回收率良好。

表4 加样回收率测定结果 (未完待续)

2.11 样品含量测定

按照供试品制备方法制备样品溶液,按照上述检测方法测定三批中试样品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1,人参皂苷Rd的含量,结果见表5。

表5 三批复方参龙胶囊5种成分测定结果 (mg/g)

3 讨论

复方参龙胶囊由西洋参、三七、黄芪、远志、当归、菖蒲、熟地黄、川芎等中药组成,经醇提、减压干燥、生药粉入药等工艺制成胶囊,具有益气活血、醒脑开窍等作用。文献报道黄芪、菖蒲、当归、川芎等,可抑制脑缺血再灌注损伤后的细胞坏死和凋亡、炎症反应等[10-12];远志有保护心脑血管、抗痴呆、增强学习记忆等药理活性[13]。三七含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等5种成分[14],西洋参含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等4种人参皂苷[9,15-18]。西洋参与三七均具有神经保护,抑制神经细胞凋亡、促进损伤修复等作用[19-24]。三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd均有保护心血管系统、中枢神经系统等作用[25-28],因此,对制剂中功效成分三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等分析与定量很有必要。

采用PDA检测器对复方参龙胶囊样品所测成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的紫外吸收曲线在200-400 nm波长范围内进行扫描,结果发现在203 nm波长处均具有最大吸收,同时依据各峰的面积值与分离度及文献[9]报道结果,选择203 nm作为检测波长。由于该制剂为中药复方,成分复杂,存在水溶性、脂溶性成分等极性差异,所以采用梯度洗脱的方法。选用不同品牌与规格的色谱柱如Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱、Kromasil C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hypersil GOLD C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、ZORBAX SB-C18150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,结果Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱较理想。比较了不同流动相系统甲醇(乙腈)-水、乙腈(甲醇)-磷酸水溶液(0.05%,0.1%,0.5%,0.8%)、乙腈(甲醇)-醋酸水溶液(0.2%,0.6%,0.8%)、乙腈(甲醇)-甲酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%)。结果,流动相系统以乙腈-0.1%磷酸水溶液系统为最佳,其图谱上各个色谱峰的分离度与保留时间较符合要求,所以选乙腈-0.1%磷酸水溶液系统作为流动相系统。对不同柱温(26,30,36,40 ℃)与流速(0.6,0.8,1.0,1.2 ml/min)进行比较,结果选择便于控制的柱温30 ℃,流速1.0 ml/min较为理想;色谱记录时间在100 min之后,无色谱峰出现。因此,选记录时间为100 min。

对供试品制备方法进行了研究,由于本制剂采用共比例乙醇提取,而西洋参与三七为生药粉入药,同时比较了甲醇、水、50%甲醇作为溶剂,处理方法采用超声(15,30,45,60 min,功率250 W,频率50 kHz与100 kHz)与加热回流(30,45,60 min);结果采用甲醇作为溶剂,超声30 min,功率250 W,频率50 kHz为宜。

专属性研究,因三七含有三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等5种成分,西洋参含有人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd等4种人参皂苷,所以选择同时缺西洋参与三七制备模拟制剂。

综上所述,建立了复方参龙胶囊成分的HPLC分析方法,测定了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的含量,该方法专属性强、重复性好、稳定简便、回收率高,可作为本品的质量控制方法,亦为该制剂的动物药代动力学和组织分布研究奠定了基础,同时功效成分的检出与定量亦为临床运用提供科学依据。